请问大家关于载体的构建的经验

songxinxing

本人最近要做一个蛋白在细胞的高表达  需要去转染6 f3 ]: w# e3 U, K7 O
现在刚开始 第一步就是要设计全长引物去P那个蛋白的全长
; w; s, N# r8 Y& [# r在此 我想询问下大家  全长引物设计的时候是直接按照cDNA序列设计么？那样的话是不是直接从atg开始查起，选择18-30的碱基对应序列  这样才可以保证设计的引物正好P出全长而又不至于 多出额外无用的氨基酸序列，局限于长度和二聚体错配GC量等等那样的话设计起来可以选择的引物种类就很少了, M' F% i; q" \0 B0 E4 \
另外有人告诉我  设计全长引物的时候应该去NCBI查找mRNA序列  从cds区上游开始设计
' A2 W, `2 V* A. b8 O我觉得那样会引入目标蛋白不需要的上游氨基酸序列# b& d# O8 c" \, J) f# D6 |

# E  h6 m% B& j/ W% m  M以前没怎么做过克隆和过表达 请各位xdjm给点建议 谢谢了

xiegm

有些载体是已经有ATG的（比如带有5‘末端标签的），这样你CDS上游序列就会被翻译，这时候最好不要上游序列。如果载体本身没有ATG，记得在你的ATG前面加入CCACC的kozak序列。

saturn

从cds区上游开始设计不会引入目标蛋白不需要的上游氨基酸序列,因为蛋白质开始翻译是从你的ATG开始翻译的,- W" D/ S# L8 u  o

% K/ a: R* X0 e. o还有就是可以考虑让公司直接合成cDNA序列,加上合适的酶切位点,这样比较方便,不过就是有点贵