版主，您好！我有几个问题，希望能够得到解答？

tnfsf10

回复 4# 烂桃
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- Z! @5 d# q2 K# w3 m版主，您好！
9 s" W2 z1 _/ e3 d! i首先非常感谢您的答复！我有几个问题，希望能够得到解答？. ?, F/ F/ P, u3 d% U. p2 Z4 T9 y6 J
1.您做BMSC，一般抽多少ml骨髓？使用什么方法分离纯化？大概可以得到多少能够贴壁细胞？* }( V7 e% L' r( A+ d8 |$ w0 ]1 @( V
2.接种密度，这么说吧，40ml骨髓，使用细胞分离液分离单个核细胞，一般可以分离10 8次方个细胞，如果接种，您使用什么密度，接种多少细胞？
/ L1 u) y2 g6 K3.原代培养，您添加其他的生长因子没有？* j* K% L" a4 C+ ?' ?
谢谢

烂桃

2-3ml骨髓，主要用全骨髓贴壁，密度梯度离心也用过，但是形态不如全骨髓的好，10 8次方首次接种的话10cm的培养皿2×106\个，原代培养我有时加一些生长因子

tnfsf10

谢谢！& s2 \: n! K  p  s
关于生长因子，我也查到一些，目前添加的比较多的是FGF-2 1ng/ml还有就是谷氨酰胺。如果不介意，不知道您可否告诉我？
1 O6 F8 m1 M3 L% Z* ~谢谢

烂桃

谷氨酰胺是必备的，培养基间隔一段时间就要补加，生长因子可以加bFGF,LIF等，至于加的两个人认为根据所用的培养体系而定，我用的是DMEM\F-12，不加生长因子长的也不错，如果用低糖的DMEM培养大多都要加

tnfsf10

我使用的是L-DMEM+10%FBS，但是细胞扩增太慢，考虑添加一些生长因子。如果采用DMEM\F12，不使用生长因子，生长速度如何？谢谢！

烂桃

回复 5# tnfsf10
& Q5 p9 V* A) [: x+ d% r# q0 u! Z5 L3 J* e- T) V7 E& H- v. O3 Q9 v
+ F5 G1 I$ |  ~, M$ M
    一传二10%FBS四天左右吧

realinter

可以用L-DMEM+10%FBS+bFGF 5ng/ml) W( M  x. x; }% ^8 l1 R
不论是克隆形成率还是生长状态会有显著的改善。
/ p8 j; [0 I2 D" ^& j% o5 k! x+ YPS：血清质量很重要，记得买好点的血清，省时，省力。

tnfsf10

非常感谢两位版主。

Robert-A

骨髓细胞的培养密度不需要很大，可以根据自己用的是培养皿还是瓶选择合适的密度，你所分离出的细胞是单个核细胞总数，而不是MSC。你选择培养面积在100平方厘米左右，效果会好很多

tnfsf10

回复 9# Robert-A 8 }) O+ V5 \2 C5 \  u+ u8 J
如果分离出来的这些单个核细胞，当然啊，其中包括MSC,如果接种到75cm2的培养瓶中，一般接种密度多大合适？! a: e) }  C, x
有的文献说是10的6次方，但是，本来干细胞就不是很多，接种太多瓶肯定影响细胞的扩增速度。
& G, Q" `/ ]- N. M& R如果改用10的7次方以上，不知道扩增效果如何？谢谢！