求助脐带间充质干细胞原代方法

wshzhoum

最近在尝试取脐带间充质干细胞原代，有如下问题请教：
: y4 r" a) M; P: ~4 \    1，脐带间充质干细胞是不是来源于华通胶，取原代时是不是就是将刨除动静脉和羊膜的剩下胶体状物质剪成1x1mm大小组织块进行贴壁( D4 W9 p. G# C/ t; y
    2，贴壁时的大概密度是多少？组织块修剪得时候需不需要泡培养基？; c0 B. k& `  t8 C+ G# w
    3，华通胶大多都黏黏的，怎样处理才能贴壁较牢？大家一般让其贴壁多久后加培养基？% z1 |4 D5 O1 R$ _) [; c
    4，大概用组织块贴壁法多久能收获第一代细胞。尝试过两次，但组织块现在都飘了，也没有见到细胞爬出......
& ?- C6 S4 `7 v( Q2 t希望各位高手赐教~不胜感激

feifa1314

同求~

烂桃

回复 1# wshzhou
  r9 q: L. N2 U0 D我现在也在做这个，条件摸索的也不成熟，和大家交流下我做这个的心得。说先我觉得脐带分离动静脉容易，剥离羊膜有点困难；由于有组织块，贴壁密度不要太大，组织尽量剪碎，加入血清、双抗及少量培养基；用培养瓶样的话我基本是过夜在翻瓶，首次培养液不要加太多，以免把组织块冲起。我做的原代大概需要10到14天能收获一代，但不纯，需要传代。

wshzhoum

回复 3# 烂桃
6 _( |2 [3 o, v9 [1 ?9 W! ]  y$ p/ L/ e. j, Q' f0 T5 R

2 Q9 }5 e$ e) m/ B) `# T    组织块之间的间距你大约控制在多少啊？第一次取原代时，组织块还能看见两个细胞趴出，但后来又消失不见了，渐渐组织块也开始漂了～还有就是剪碎的组织块胶多不多，我们现在是用组织块浸泡后１２加培养液，可现在基本不见细胞爬出～请教！

烂桃

回复 4# wshzhoum
& X: G' }4 J" B0 e! R2 ^* d8 w0 J$ M" U0 F, m! C

! G" _5 a: x2 N2 T* c1 j0 M2 t    我是剪碎过后加培养基和血清，大概300-400微升铺一个小培养瓶

xiegm

参考下这个吧
* y! @3 _* J/ `# pfrom In Vitro Cell.Dev.Biol.—Animal (2009) 45:573–576$ \$ D5 Y6 S( c1 |- k* j& ]$ s
To isolate stem cells, umbilical cord samples: y7 k! S* \! H( B1 m/ I
were rinsed in 75% ethanol (Sigma, Poole, UK) for 30 s
- s4 x5 c. u; R$ s7 r$ qand cut open in parallel to umbilical cord vessels, so as
1 X8 |4 @" u# \! E$ k, N, ?, O7 ~to expose them fully. The gelatinous tissue surrounding3 K6 R2 j0 L2 `, E
the vessels was excised and minced into very fine pieces
9 O, N. E" Z$ tof 0.5–1 mm2, which were plated on a sterile 100×20 mm
/ b$ K8 y) B: O/ V; |! n$ Rpetri dish (Corning, Ewloe, UK) and left for 5–10 min at
$ p7 p, e& W  qroom temperature, to facilitate tissue attachment. The
3 r* w1 ^& K5 \5 q% v& E9 gminced tissue was carefully covered with 5 ml of growth
; f$ i$ C" H% n) Pmedium comprised of low-glucose DMEM supplemented! m4 ?9 g! `: p& a
with 10% foetal bovine serum, 2 mM L-glutamine,, A2 t" H8 h0 c8 w6 w
penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml) solution,
3 @% U' O+ O1 K+ Z; W5 f+ X25 μg/ml Fungizone, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor
7 a1 E$ v2 j& Y4 eand 5 ng/ml epidermal growth factor (all from Invitrogen,$ }8 ~1 m7 a7 X
Paisley, UK). WJ samples were incubated at 37°C in a
  o) w5 L6 R8 r7 m+ D5 n( [  Q, thumidified CO2 incubator for 5–10 d, before visible colonies! i9 N/ E* y' e8 m5 h5 O
of WJ HUMSCs were observed.

香瓜瓜

羊膜的剥离确实有难度，而且很容易把胶层也损耗掉。所以不用强求羊膜的剥离程度。贴壁时间主要看种的时候组织块粘稠度了，我不加培养基或pbs稀释，原代时间挺长，大概要16天，不排除有某些细胞已经老化的可能。所以消化法如果成熟的话是个不错的选择。

zsc78

只要把3根血管剔除就可了，剥离羊膜比较难，我没有剥离，培养的效果还不错。就是原代需要的时间比较长。

wshzhoum

回复 5# 烂桃
9 P8 y: v9 V% S4 l$ G/ b6 X0 J+ k8 J! y6 J5 P9 R

( [- {8 t6 x6 l/ s% J好的~再重新试一下~万分感谢~