请教：小分子蛋白的western问题

托斯卡纳教父

我是想检测血清里面的一个低风度蛋白的表达。分子量为11KD。我提取了血清之后用丙酮沉淀浓缩了。跑的15%的胶。溴酚蓝跑到分离胶一半的样子就停了开始转膜。但是一直没检测到任何信号。大家帮我分析一下吧

sgzhong

你可以先染色看看你的目的蛋白是否有的，再转膜。11KD跑15%PAGE足够了

dwc326

推荐试一下tricine-SDS-PAGE胶！（我一直用的就是10%这个浓度，把8KD和280KD都做出来了）
' V/ D3 ]- F4 U! S7 w+ S
4 [4 b; n: x" Q2 ~3 UTricine-SDS-PAGE胶的配方
( ~8 K) O* w. p. a8 @) t; d       分离胶 积层胶" ]" h4 h' B* t6 X; {& e' U
ddH2O 1.85 mL 2 mL
$ h8 F3 l0 A4 N  y4 z' iAB-3 1 mL 250 uL
9 E: @, v3 `  s+ B" ^Gel-Buffer(3*) 1.65 mL 750 uL' C# g3 y# A  k# E
甘油    0.5 mL —
, h; J5 K) A+ ?6 J+ ^10%AP 25 uL 22.5 uL  ]3 ]7 @' b! L; X# f4 W
TEMED 2.5 uL 2.25 uL
% `) ~' k' k. O2 D3 g) U0 h  t3 n' U) }# t& ~# {6 ?% n0 E
  c) o. m6 r: x- p. x
3*Gel-Buffer 配方：(200mL量)5 ?- T) j) w* Z8 R- z% T
Tris-Base 48.44g
& k! d6 W) @5 STris-HCl 31.52g0 @9 q- W; s# K8 u, _! n, \& \4 m0 K
SDS 0.6 g
3 n( F6 ?6 y* s/ @- ApH 8.45,很难溶，可以60°C水浴促进溶解。, s% O  B$ g3 d/ r# u* B  h
6 B2 e# c/ \3 Z, o7 {/ M
AB-3 (100mL量)3 A5 v- j, D8 a& T' B7 ~' u
丙烯 48g
9 C0 Z( ?) l" b( Z1 S双叉丙烯酰胺 1.5g
3 e. {6 L2 l4 s注意：丙烯溶解后会使溶液体积增大，故只要用约80mL水溶解即可，完全溶解后再定容。通风橱内操作，注意保护自己！
& A, Q; C7 i5 H' R
2 Z- L8 |; ?; G# n' E9 d外槽电泳液（+极）（Anode Buffer）10*8 n  Y8 x# P- S( |
Tris-Base 46.92g. h5 @7 r  g4 y8 |
Tris-HCl 17.73g# U- z2 g  g& K# k# g
500mL体积，pH 8.9。
6 u2 A3 y5 _4 P6 p' R& w4 N8 T/ N: T7 h5 ]
内槽电泳液（-极）（Cathode Buffer）10*) H% s" R0 @. r! I  U
Tris-Base 24.22g
0 o* H1 \2 Q% S& q( w2 LTricine 35.84g- w; W9 {3 U. \( a+ y7 J
SDS 2g+ `, X% y$ y5 _( d+ }6 d
200mL体积，pH 约8.25。0 V% L2 B" h' V/ O5 t1 R
（原文：http://www.dxy.cn/bbs/post/view? ... &sty=1#17139060）

dwc326

我做的是8KD的Ub蛋白，效果很好！而且条带压的很好，相邻泳道间不相连，图很漂亮。2 v& K* a+ ^# V2 L7 ?( h
建议湿转，30V 2h适合90KD以下所有蛋白。

xiegm

抗体是否好用呢？也有可能不是Western blot的问题，样品收集时目的蛋白的浓度是否太低了？样品中可以加入一个过量表达蛋白的阳性对照看看western系统是否有问题。

托斯卡纳教父

回复 5# xiegm * l: H  A7 h2 G9 f5 T) N6 \

3 U) W$ L0 L6 k! y% A& {; J# s( C
    我觉得可能是抗体问题  因为我试过以前自己克隆的蛋白做阳性对照 还是没有带

yueyongheng

是不是转印出了问题，如果目的蛋白没转到膜上就不可能有信号啊。

weiyepan

转的时间太长了吧，你用什么膜，什么方法转？如果半干的话可能10分钟就够了。
$ a* t& m  G' K2 U- }/ Q另外建议直接把蛋白滴到膜上做个dot blot，作为阳性对照，看抗体是否出了问题，或者你蛋白丰度是否能检测出来。