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先总结一下我的实验过程：9 s1 m. N6 p0 {
（1）2月龄兔，腹腔麻醉，穿刺取骨髓4ml.
4 A: O* y2 |- f（2）先与Gibco L-DMEM混合，离心2500r×10min，弃上清。* t" e; ~: P. [) t) J7 K+ l* n
（3）完全培养基（Gibco L-DMEM+10% Gibco FBS）混合沉淀，离心2500r×10min，弃上清。
9 }$ k5 T" i! T) ^! @7 T（4）沉淀分两个10cm培养盘，各加完全培养基10ml,5%CO2，37度培养。
; w* w' P6 @8 N7 I) M( `. Q（5）五天后第一次换液，此后每两天换液。
7 B" d1 O: c/ C; b8 Q4 X K/ T' T# O( D1 t2 w3 {* T: G
碰到问题如下：
, K& ?, J9 E6 `# C+ y1 f1 `0 u（1）第一次换液观察，可见有梭形细胞出现，细胞呈极性伸展；也存在多角形细胞。5 m) O1 G, @% k+ ~4 u
（2）第二次换液，可见有的细胞单个生长，有的形成克隆，但是各个克隆的细胞密度不一致，' v9 {5 Y3 _$ l& F; p' g- d
有些密集，有些稀疏。& }: D* E" t7 S# O
（3）第三次换液后，稀疏的克隆里，细胞能保持清晰的边缘，立体感强。: s! n0 p. \3 h. ?# f$ ^5 n# U
密集的克隆里细胞非常“拥挤”，立体感变差。
) L$ v/ U2 _' _# n0 B（4）为了防止密集克隆里细胞过密生长，使用0.25%胰酶消化传代（未加EDTA，但细胞很容易消化），离心。
6 y" a4 o% F1 a; n 此时细胞还不能铺满单层。
_4 j1 P6 C: E7 ^（5）传代过夜后观察，细胞状态变差，铺展得很扁平（如图）。) G9 |6 z/ H2 K8 x% [, L( m
8 }3 Y: @+ N+ ~
* w8 z* M( X" G% J. [* W( c. z$ F1 V& t" [$ X, `/ @& O6 p7 b
现在需要请教各位
; \) b" O3 |$ ?（1）为什么各个克隆的细胞密度会出现差异？* p4 G% f4 |$ q/ I3 b7 Y
（2）为什么传代后细胞的状态与原代相比会变化这么大？+ ~. m. G2 s) C9 w
（3）原代细胞需要生长到什么状态，再进行传代比较好？
0 L+ x$ z! V! ~& Q0 D' h M' O' R 消化，传代操作有什么特别要注意的？
& C8 M; K2 k9 J- j6 a8 Z 有老师介绍说不用吹打，可以用刮，行不行？
5 w9 h7 n; A# k( T! {! \
5 Q( a, w% ]: e. u谢谢各位了！ |
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发表于 2010-5-4 10:38
