原代培养问题 - 干细胞分化技术专区干细胞之家



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查看: 32998\|回复: 10	go 原代培养问题 [复制链接]

qingyueqingfeng

新手上路

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楼主

发表于 2010-5-11 19:59 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

请教一下各位做组织的原代培养，消化法多长时间，具体是几分钟终止消化一次?我现在在做组织的原代培养，5分钟消化终止一次，共1h，用台盼蓝染色，见未染色细胞。培养细胞死亡。请各位帮忙分析一下原因。培养基用的是文献中的DMEM+FBS。

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沙发

发表于 2010-5-11 21:20 |只看该作者

你做的是什么样的组织呀？

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kqyy

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藤椅

发表于 2010-5-11 21:21 |只看该作者

请明确告诉
1\组织来源,和欲取的组织细胞3 F: y r' L0 S+ j. i# O
2\用什么酶消化% w4 `8 j% M) ]$ [
3\你怎么判断细胞死亡的

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qingyueqingfeng

新手上路

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板凳

发表于 2010-5-12 22:26 |只看该作者

脐带组织，用0.25%胰酶消化，养4-5天后无细胞贴壁，有成团的细胞已成絮状漂浮在培养基表面，呈黄色。

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cony

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报纸

发表于 2010-5-17 22:19 |只看该作者

试试一次消化法。消化后过滤离心。

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qingyueqingfeng

新手上路

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地板

发表于 2010-5-18 00:41 |只看该作者

以上方法已用过，但是没有细胞存活，个人分析可能是胰酶作用时间太长或浓度太高对细胞有损伤

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dragon513

版主

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7楼

发表于 2010-5-20 22:33 |只看该作者

没做过脐带的不过胰酶消化1h是有点长

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dingyx2009

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优秀会员金话筒

8楼

发表于 2010-6-2 21:13 |只看该作者

就你所描述的情况，应该是胰酶消化太长，细胞严重损伤，全部是细胞碎片，悬浮液体中。我没做过脐带组织，但我想原代培养的方法应该是可以借鉴的。将组织尽可以剪碎，0.25％的胰酶消化20分钟作用，37度孵育，10分钟时取出摇匀，使消化充分。时间到时立即用10％血清的培养基终止消化，若组织粘稠可以直接用不含血清的培养基漂洗两次后，（组织较散时，先离心再漂洗）再加你要用的培养基吹打，制成单细胞悬液，计数，种植。9 i9 f6 N8 j3 \5 `8 _8 A7 L9 O3 p
另外，感觉组织量大或难以消化，可以调整胰酶的浓度（加大）。消化孵育时，摇匀每5分钟一次，时间20－25分钟足矣。