细胞培养中的黑胶虫问题 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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qingnuanrenxin

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楼主

发表于 2010-5-16 12:03 |只看该作者 |正序浏览 |打印

我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。; W% f0 P! }. K, p* u8 z, O
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黑焦虫的特点：" E1 D. B9 `( G/ l4 t# L5 l5 U
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1、与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多。

2、对抗生素无效。6 y7 x9 p" C( ]

3、可能通过培养箱空气进行污染。
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4、单用培养液及血清培养没发现问题。/ Z9 l5 w2 ]8 b5 D4 Q

5、换掖冲洗后也无效。
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以下是论坛里我找来的相关帖子内容。“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题% j. g5 p: B6 ]3 x& N  D
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关于是什么的问题的讨论：

1、玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）。
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2、据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法。3 G' s! t! N+ ^- Q0 v

3、据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。9 ~+ R0 s! C6 @4 t% r1 ?8 J( m
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4、有人说是纳米级的细菌。1 N$ q+ _! B# a& H  B, a
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其他的特点：
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1、形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米。  ]8 W% l5 I& i7 ^# ?* n0 V& C$ M, C

2、在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。

3、细胞内好像也有存在。

4、但并不引起培养液混浊。

5、时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡。7 v3 b- ]$ p8 ]$ b

大家的处理：
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1、换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。

2、如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。

3、换用进口的一次性塑料培养瓶。7 I0 S- g7 G* q

4、建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏。" b$ z6 w3 k) @0 v
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5、在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。

6、有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。
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黑焦虫很难根除，最好的办法就是舍弃并进行全面的熏蒸杀菌我们实验室也污染了一次，后来熏蒸了一个星期，换气也用了1个星期，后来就好了，期间我也用什么换血清等方法弄过，不过作用不大，过几天那个又多了。呵呵，还是彻底的消毒一次好啊。

我养的人的肝细胞也出现类似上面楼主说的“黑胶虫”。自己的观察和楼主还是有点区别：我用条件培养基(不含血清和二抗)长期培养细胞，每两天就更换，新配的培养基。在培养一个星期就出现类似“黑胶虫”的东西。胞浆和上清中均有那种东西，换液以后好像澄清了一点，第二天又出现了，这东西对细胞的生长也有些影响，细胞有的脱落死掉了。因为培养时间不久，还不知道是细胞在培养的过程中本身的原因还是黑胶虫的的影响。可以肯定可以和细胞共生。奇怪的是：我在用含血清（PAA公司小牛血清）培养基作对照的六孔板中发现，那上清中却是澄清的，三个复孔也是澄清的。1.当时怀疑是我是不是没加二抗的原因，后在条件培养基中加入二抗以后，发觉效果还是不明显。2.怀疑是不是条件培养基本身就含有那东西，于是将一部分培养基也放入培养瓶中培养。也没发现有那东西。! {6 I  J! V, n
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最后个人的结论：这种东西在可能本身就寄生于人和动物的细胞内。二抗对其效果不明显。血清中可能存在有一种物质可以抑制其生长。细胞离开特有的免疫环境，很多被抑制生长的，寄生于细胞内的生物就开始生长，这种情况类似于HIV感染引起的感染一样。解决的办法也是很迷漫。至今也没什么办法。在和战友们的的交流和学习中找到对付这种黑胶虫的办法。3 u/ R  O2 |4 h# R4 }: R0 ?8 n

有关血清使用中的常见问题解答。数十年来我们始终面临的是同样的问题。因此，我们特别整理了一些实验室里常会遇到的问题，供大家参考：9 n; r; {7 R! C7 I5 {* s

1、保存血清最好的办法？

我们建议血清应保存在-5℃至-20℃。若你一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
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2、如何解冻血清才不会使产品质量受损？9 D  E" _+ [. k

我们建议您将血清从冷冻箱中取出后，先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。- C, ~5 J/ c' G; {" N# }; Y8 |
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3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？2 l1 i( w" |3 \2 |5 N
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血清中沉淀物的出现有许多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性造成的；而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管中，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。
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4、何谓热灭活？有必要做热灭活吗？

一般以56℃，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活性，而补体所参与的反应有：溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经过处理的血清对细胞生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者认为是微生物的分裂扩增。因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热灭活这一步。如此以来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！8 {' k, G- G/ I- R/ \7 r% g) B
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5、如何避免沉淀物的出现？8 T( u4 q  m: L' a8 f7 \7 |
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我们建议您在使用血清的时候，注意正确的血清解冻步骤，并尽量避免灭活血清及长时间的将血清置于高温环境中。
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来源：http://www.perbio.com.cn/Hyclone/page/note.htm

我认为所谓”黑胶虫“应该是血清中的物质在热灭活后形成的聚合物，在常温下做无规则的布朗运动，看上去像虫子而已。因为血清中的营养物质聚合，变得不能被细胞利用，所以细胞失去营养支持，逐渐”状态不好“，甚至死亡。

我观察到的现象和 wxgang战友一样，我养的是u251细胞，刚开始养在皿里面的时候有双抗有血清，生长很好，两天传代一次，之后我就开始铺在12孔板作转染，作转染的时候我们是换无血清无双抗培养基，而且转染之后不换液培养48h，结果全面污染了，我想可能是操作有问题，重复了一次又失败，我觉的我手气不好，就另请同学做了一次，铺板转染全是她做的，结果也是全面污染，我想是不是因为在皿里面养的时候一直加双抗抑制了细菌的生长，有隐性污染，我就换了无双抗有血清的培养基培养细胞，结果还是长得好好的，两天传代，一点问题都没有，我想做转染唯一换了条件的就是换成无血清培养基，那些细菌一样的东西就出来了，后来我就把皿里面的培养基换成双无只1640的培养基，结果24小时之后，那些东西就按耐不住，全钻出来了，我也觉得它们是寄生在细胞里面的，就像人体的寄生虫一样，血清撤掉了，没有营养了，它们饿了就全钻出来了，说得比较通俗，见笑，我被这株细胞搞得心慌慌的，也不敢动其他细胞了，害怕造成交叉污染。这种东西藏的很好，细胞正常培养是一点问题都没有，好的不得了，混在好细胞当中，要是他把别的细胞给污染了，我就要气死了。最后他全面释放出来的时候像是细菌污染，因为培养基变浑浊了，细胞全都死了，它密密麻麻繁殖了很多，浮在培养基上。我也搞不清楚到底怎么回事，也没有办法解决，仅提出自己的实验现象供大家参考。 6 O7 W$ V9 D8 T4 Q

我和楼上的 lamnon的情况极为相似。我前两天复苏了一管别人冻存的小鼠成纤维细胞，长得还可以,四天后传代，今天是传代后的第二天发现三瓶中有一瓶的培养液很快就变成橘黄色,另外两瓶还可以. 于是我就把那瓶变色的换液了，可是换完液就觉得又变黄色了,，镜下观察细胞很不规则,胞核有的就看不到,而且胞质和胞核里面有很多黑色小点.。. l3 v# h% [6 ]6 S+ }9 u- T+ l

我觉得对于黑胶虫的定义非常需要规范化。我对这种东西持保留态度，一是我自己还没有遇到过，二是我们的的确确还不知道这种所谓的“微生物”本质是什么东西。也就因为界定的模糊，现在有很多同行遇到问题很容易就往“黑胶虫”上归咎，其实很有可能只是细胞状态不好时漂点碎片，包括支原体污染导致的，或者血清灭活时间长了出沉淀之类，可一旦归咎于“黑胶虫”，就好像名正言顺的成了“不可抗力”：反正我也不知道是怎么回事，姑且就当是“黑胶虫”吧。可能进来的同行看到这里砖头已经举到半空了，但我认为这问题是确实存在的，需要大家重视。除了上面几位令人尊敬的积极做实验证实的同行们，进这贴的人可能有很多都是细胞不明原因的状态不好，进来看看能不能靠上“黑胶虫”的边的。我们是做科学的，而现在“黑胶虫”已经快成了我们科研中的迷信，请慎重讨论“黑胶虫”，不要轻易用一个不知道是什么的东西来试图解释手中的现象，希望你相信自己的困惑是可以用我们目前已知的原因解释并且可以解决的，认真寻找原因才是正道。" W! H7 z" y/ F/ \

黑焦虫就是以讹传讹造出来的，大家不要再人云亦云了，拿出点实证的科学精神出来。事实和证据是科学家的空气，虚无缥缈的东西应该从脑海里清除出去。* R3 \% h* b2 U  |' x' G/ [  U

很多人还在沿用热灭活血清的老传统，但是这样会使血清中产生蛋白质的聚合体，像线状的小虫，做布朗运动。其实血清不应该热灭活的。这种情况应该能回答很大一部分同学的黑jiao虫现象。其他的可能是一般污染，或者是死细胞的碎片。总之，一种莫须有的虫子不应该成为大家讨论的话题。

有人说它是“黑焦虫”有人说它是“黑胶虫”还有人说它是“黑蛟虫”这3个名称都有人用。难道是一种未曾发现的新的生命形式？或者是已知物种，而我们鉴别不出来？或者根本就不是什么虫子？我也曾培养出这种“黑焦虫”，很像的，在20X10的倒置显微镜下，是半个细胞长度的黑色线状物体，密密麻麻，还在原地微微的动。把培养液直接37度孵育24小时，也有这种线状物体出现。后来再也没有与它遭遇了。希望培养出“黑焦虫”的同学能发图片上来，高倍清晰的，让大家看看各自的虫子都是什么样的。我的图片可惜已经找不到了。 2 t/ y1 H. C7 S, U1 O8 ?4 [4 H4 R
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上面说的比较清楚，当细胞状态好的时候，那所谓的原胶虫很少，当细胞状态不好的时候，逐渐变多，而且是形成一种所谓的共生关系．我们现在也遇到此种问题，上病毒的细胞由于有病毒的侵袭，可能活力会降低，逐渐的就会有很多的小黑点出现，而空白对照的细胞根本就不会出现此种现象，所以如果只用单种因素来排除而不从整体上进行，是不合理的。
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有点意思。自己遇到过。但是对此“黑胶虫”保留态度，认为和血清有一定关系。而“虫子”、还有所谓“专杀培养基”觉得有点夸张了，还是“全世界范围普遍存在，解决该问题是一个世界性难题。”。哈哈，这样的话多少科学家会自动放下手中的工作，暂时攻克这一“世界性难题”？科学发展至今，科学疯子们会容许这样一个模棱两可的未知生物在眼片地下而置之不理？ * D* x- `1 V) r& S# Z3 W2 I

在别处看到的，转载来，大家看看：有人认为是“黑胶虫”，也有人认为是支原体，还有些专家更倾向于是非微生物，系血清中的杂质。下面就我所知道的谈谈两者的情况和对付方案：

“黑胶虫”7 L& K# F8 U% S7 ~# J. V* o8 e
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胶虫成熟后呈线状,可以快速移动。而且形态是椭圆形，作不规则布朗运动。如果血清从-20℃取出后在室温下融化就易出现“黑胶虫”，建议血清在4度融化。加入双抗后好像能够抑制生长（具体原因不明，抗生素应该对细菌起作用）。
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建议：7 e- u5 ~, T. Q# B( w

1、停止复苏，停止养细胞，彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品，包括所用的培养瓶，培养基，吸管，胰酶，孵箱，超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品。一个星期后，再复苏污染之前冻存的细胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。这样你可能觉得动作太大，但可以用一个星期的时间挽救两个月的时间，还有其他你为了找到污染源，去除污染所耗费的精力，和财力。

2、如用伯氨奎、磺胺、四环素、贝尼尔，也有建议庆大霉素500ug/ml洗涤。如果细胞非常珍贵，可以用PBS多洗几次，培养基内加浓度高些的抗生素，勤换液，勤观察。

3、所有东西最好重配；如果实在要抢救，重点突破，留几瓶污染不是很严重的细胞抢救，其余弃去．
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4、另外尽量用质量好的血清，当然最好是进口胎牛血清（国产血清太脏），就是价格高的离谱，经济条件不允许，可以用进口新生牛血清代替。建议如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必灭活，这样可以有效减少“小黑点”的形成。 - ~% \/ _; G4 V' _# X
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支原体污染/ Z  X5 _/ I) q  D0 f; p

由于口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。0 o: n- k5 Q3 x: g- ]7 L. ^2 Q

去除支原体污染：
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1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）6 [) q' I/ _$ y9 k  C

2、 Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 8 {: i  k$ q3 D" q& [$ D; _

3、Anti-sera : C& e" A$ A  ]/ ]
& }) A* q% j4 u3 N1 q& e$ L$ u
预防与控制方面可从以下各点加强注意：) J( b! Q1 R5 ^/ r

1、设备方面：

（1）使用已作支原体测试ok的细胞株 9 V6 S6 v2 K% a- \9 p
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（2）于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染的细胞 7 x' y8 A3 @+ z; U- `
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（3）使用不添加抗生素的培养基培养细胞 ' a! |" Z( w3 ^
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2、检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。% y4 c9 U9 }4 ~; M5 x& q

3、实验操作人员的无菌观念与无菌操作技术的要求

我们实验室养的细胞中也出现了做布朗运动的小黑点,但并不影响细胞生长也没有出现过细胞死亡的现象。听昆明动物所的专家说这些小黑点是细胞凋亡后形成的凋亡小体。我们开始用1640培养细胞时小黑点比较多后来由于1640用完了换成MEM+LH后小黑点明显减少了，所以我觉得可能与培养基有关。我们实验室以前也出现过“黑胶虫”污染，但是我们污染“黑胶虫”后，传代后第二天培养液就会变黄，在培养液中直径小些的“黑胶虫”做快速转圈运动，直径大的做慢速的摆尾运动。而且可以通过0.22um滤膜。更换血清后就再也没有出现这种情况了。

我们学校电脑的网络换了，换了之后网速慢的要死，大家经常反映，学校最后在校内网，发出公告，说部分同学的电脑中毒，导致网速很慢，请同学及时杀毒。我就奇怪了，以前没换网时怎么就没事呢？现在有个怪现象，就是电脑方面的事都喜欢往病毒上靠。现在在细胞培养上，有个怪现象，什么都喜欢往“黑胶虫”上靠。我不敢否定“黑胶虫”的存在，因为我对他没有太多的了解，没有太多的了解的东西，一般是没有发言权的。但是，它是一个没有肯定，没有明确定义的东西，为什么那么多的战友很肯定的说，自己曾经或者正在被它污染呢？我看dongyisheng2007战友发了张照片，这很好，我感觉，也是我想说的就是大家都把自己的“黑胶虫”照片帖出来，细胞培养，照片很重要的。我很奇怪的就是，大家说的眉飞色舞，滔滔不绝，怎么就不发照片呢？我是很怀疑的。dongyisheng2007战友发的照片，我说说我的看法，有很多战友说“黑胶虫”是细胞内的，和细胞关系很紧密的，但dongyisheng2007战友发的照片上，我没怎么看到细胞呀？是否可以说，很多战友间说得所谓的“黑胶虫”并不相同。我认为我们做事应该本着实事求是的态度。我刚培养的时候，买来胎牛血清，上面写明未灭活。有资料显示要灭货（56摄氏度，30分钟）。但是我就没灭活，因为我有个疑问，为什么厂家不灭活？他们灭活多简单呀。什么原因呢？如果资料或者胎牛血清上写明：现用灭活效果好的话那也可以理解，但没有这样的字样。那就说不通了，为什么厂家自己不灭活？后来我在生命经纬找到了答案，现在一般不主张灭活。现在“黑胶虫”的问题还没有定论，我们不能否定它的存在，有可能我们很多年后对它有认识，有了解，但也有可能它根本就不存在。我们现在就否定“黑胶虫”是不正确的，但是把什么都说成“黑胶虫”就更不正确了。我的建议是，我这帖以下的说发现“黑胶虫”的战友都把照片帖上来，以前发帖说发现“黑胶虫”的把照片补贴上。不知大家同意否？ # M- h( |) i3 h& z8 M& e. ~; O7 U

我做细胞培养工作已经有二十余年,上面提到的“黑胶虫”问题经常碰到,采取了许多措施也不易挽回被污染的细胞,后来每次发现有这种微生出现时,我就吸取少量液体进行高渗培养,结果大部分标本培养出细胞L型,少部分标本经过很长时间仍不能诱导培养出L型菌生长.分析认为:在正常高渗培养时,也会有一部分标本培养不成功,这是主要原因,这些“黑胶虫”主要来源于细胞培养板,因此大家在做培养时一定要处理好培养用具.以免影响实验结果。

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12楼

发表于 2011-7-1 11:15 |只看该作者

黑胶虫问题比较严重来源也很多如果是黑胶虫，建议直接扔掉否则会影响实验室其他细胞的培养我们在上海细胞库买的细胞也是这样买回后放入液氮罐里等我们拿出来复苏的时候就已经发现有问题我们立刻联系细胞库人员进行拍照传给他们后来发现时他们的问题就又换一株细胞过来

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linzi0214

新手上路

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11楼

发表于 2011-7-1 09:50 |只看该作者

本帖最后由 linzi0214 于 2011-7-1 09:51 编辑 7 \( z7 `- W9 U. q5 A/ `# S9 f

以前我们实验室也出现过这种问题，建议使用可以使用西美杰公司的支原体检测试剂盒检测是否存在支原体污染，使用InvivoGen公司的抗支原体药物（Plasmocin™）进行抗支原体处理。