求助成年小鼠SVZ取材详细步骤

yhy313

成年小鼠SVZ取材及原代培养的详细步骤。谢谢！- ~% N' G' Q! I5 q

# F, s# V% u. N. N% _0 u9 X以下是从第三军医大博士毕业论文上摘下来的，请各路高手指导，看是否需要改进，主要是想在SVZ取材方面获取指导，非常感谢！8 A4 c7 q: t0 i8 E
1．        取8周龄C57雄性小鼠，腹腔麻醉。
% U. W* R9 Y+ V% J0 @4 m2．        头部70％酒精消毒。& u- o0 g& |2 k" E+ w9 S
3．        剪刀从颈部断离头部，剪开头皮、颅骨，取出大脑，置于盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中。
8 H. f* D  n$ y& I6 J5 I. V1 H4．        去除血迹，放入另一盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中，去除脑膜，在显微镜下操作。4 w: L* X" L) g
5．        将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。
1 \0 z5 X) L/ C) ^6．        将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。. A: l1 x! t0 E6 Q1 o. ]8 B5 K
7．        分离之，去除四周的白质纤维。取出置于无菌的1．5毫升Eppendorf离心管中，置于冰中。$ |" e" A$ p9 V8 I" I- X' f
8．        同样分离另一侧的。
. d$ ?- n2 L6 _9．        每个离心管中加入400ul的0.1％含EDTA的胰酶。0 Y; Z8 W+ G. L+ Z" W( z
10．        轻柔吹打5～10次，将组织吹打成细块状(使用1000ul的蓝色枪头)。" ?" a8 g1 p3 N6 A' L" G+ ?
11．        37℃孵育10分钟。每个样本组织再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织消化成小的颗粒。
* E3 \; g* K, f+ l* M2 H( i3 H, N1 c12．        37℃再次孵育10分钟，再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织完全消化成单个细胞。
! f& W' @* C' p. L# D( |1 R13．        可以酌情延长消化时间和次数，最终使得组织完全消化成单个细胞。8 |4 [- R0 H- E% a4 s
14．        每个离心管中加入4001xl的NSCs培养基终止消化。
: N0 Y; Z$ @. J9 j5 Q15．        常温下O.3 rcf离心3分钟。3 v8 o# X- T) i+ W
16．        去上清，加入培养基洗涤一次，再次0．3 rcf离心3分钟。
9 @$ m, H" g' K0 J0 q3 J- ~17．        去上清，加入培养基轻柔的重悬细胞。2 @+ |8 p/ M8 q" K1 y% y4 Z
18．        移入50ml的培养瓶中培养，每瓶加约10ml培养基（培养基为DMEM/F12(1:1)，每50ml中添加了青霉素．链霉素500微升，N2 500ul， B27 1ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml）。约7～8天后神经球形成。% {/ Q) F. z- G
19．        将培养瓶放置在倒置显微镜下进行神经球计数。
3 b9 F  O' Y4 g0 J; k& h; H20．        在24小时后换液一次，换出死细胞和其它杂质。
5 x7 C' F8 v6 l3 ~% L+ p, _$ t+ ~/ i21．        观察到神经球长到约200um大小时即可传代。

iseeyou1210

very good!

yhy313

另一种取材方法：
3 ]4 [5 x+ s3 A: e( o

ambassador

我来补充一下SVZ神经干细胞的知识吧！2 p2 x, j6 _. g/ b; H9 f
附上这篇第三军医大学2003年发的：
! R0 Y+ s) q; D8 xSVZ神经干细胞和祖细胞" Q. Y3 \6 p% M6 w

beidouhan

不错的分享

smkx

谢谢

mumudan

请问楼主，你每次分离的时候都能看到明显的透明条带吗？能很准确的取到那个区域吗？我最近也在取，貌似方法不是很好，可否交流下！