如何熟练Q-PCR手法

曲遥

很困扰，做下调实验要求手法精准，尤其是做三个复管时，不知道怎么样手法能精准

gyuxutong

同样的问题，求教

lixiaodong

RNA提取要完整，注意消除基因组DNA（视引物，如跨内含子则可能不要求），电泳检测RNA带型完整。之后反转要充分，注意RNA用量和反应体系，不要overload。Taqman probe可能特异性更强。如用SYBR green，要看是否有非特异性扩增产物及引物多聚体，注意读荧光的温度（可据溶解曲线分析，在曲线的半峰值处读取荧光，消除非特异性产物的影响）。另外推荐用试剂盒和热启动Taq作实验，自己配的buffer体系很难消除SYBR对PCR的抑制作用，起峰较晚，不灵敏。