技术新进展：生命科学的3D风潮

细胞海洋

当电影《阿凡达》以27亿美元的巨额票房席卷全球，创造了一个崭新的纪录之后，各行各业随之都刮起了3D风潮，出现了3D报纸，3D时装秀等等，将2010年变成了一个3D年。1 e/ _: }4 \4 r" r
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在生命科学领域中，我们同样也看见了3D风潮：3D细胞培养，活细胞立体成像，基因组3D模型，3D图像计算技术等等，这些先进的技术让我们能对于生命这个神秘的机体获得越来越清晰的感官认识。
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3D细胞培养. ]- n$ r; }' y
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传统细胞培养技术在模拟细胞体内生存环境方面做得还不够。3D细胞培养技术则能在细胞培养过程中，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境。这种技术在基础科学研究和制药研究中极大地提高了细胞实验的准确性，而且随着培养原料的数量和复杂度的增加，3D细胞培养技术的应用也会随之增加。* t7 c/ o7 l8 f! H
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来自俄亥俄州立大学William G. Lowrie化学与生物膜工程研究院的华裔科学家杨尚天教授在3D细胞培养技术方面获得了许多重要的成果，他已经使用3D细胞培养技术培养包括人胚胎干细胞和结肠癌细胞在内的许多不同类型的人源细胞。
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杨教授用来在体外模拟体内生长条件的基本材料是一种聚对苯甲酸乙二醇酯纤维——一种具有非降解、生物兼容性和非纺织的纤维材料。其实验采用3D细胞培养技术的一个主要原因就是3D培养得到的细胞形态比2D培养的更加精确，并且细胞形态常常对细胞的功能（信号转导等）产生影响，他已经开始通过他的3D细胞培养系统来筛选抗癌药物。
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! h" z/ S6 u- x6 D近期他的研究小组又提出了一种新的培养细胞接种的方式，这将有助于3D细胞培养技术在实践中的更多应用，也有助于3D细胞培养技术往高通量筛选方面发展。
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研究人员提出了一种新型离心接种方法，这种方面利用两种不同的多孔性（93%和88%）可以提高PET材料中细胞的接种效率，其中离心力和离心时间都可以影响接种效率。优化离心速度后，可以达到高至80％-90％的细胞接种效率，而且时间也只是需要不到5分钟的时间。7 ?$ B# @. w, ]# f- J( ~, ]* s

' X5 h# X- L% ~/ A- }研究人员发现不同孔材料的接种效率相近，不过疏孔架能最佳缩短接种的时间。并且他们还在结肠癌细胞的培养过程中证明了这一方面的有效性。这种方法有助于3D细胞培养技术往高通量筛选方面发展，也有利于这一技术更有效的用于各个方面。! P: v7 i1 v' u* h2 I9 d

3 C; z+ S1 L) a3 n杨博士在细胞培养方面获得了许多新成果，比如06年其研究组就开发了一种组织生长设备（tissue-growing device），能够用于培养成人干细胞，并且能够使研究人员对培养过程中的每个胚胎干细胞进行紧密跟踪。新型bioreactor有两个格室（chamber），一个格室内包含可以支持干细胞生长的高聚物螺纹，一个格室内含有液态培养基。这种液态培养基能够向干细胞传递炎症因子，维持干细胞未分化状态。5 [) l. _- ?. ^1 }+ m7 O

( F1 b# o' R. Y5 F$ `* U实验过程中，研究人员分别在flask中（传统细胞培养方法）和bioreactor中的标准高聚物螺纹（strands of polymer threads，生物通编者译）上培养小鼠干细胞。用flask和用bioreactor培养干细胞的不同之处在于：细胞在bioreactor中能够向三维空间生长，而在flask的底部平面上只能向二维平面上生长。
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基因组3D模型. d3 o* x0 u( _% J- L+ V0 b3 V
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阐明染色体的复杂结构，了解基因如何被遥远的元件所调控，这一直是众多研究人员的梦想。近年来染色体构象捕获（3C）及其衍生技术的出现，让研究人员检测到染色体内部和染色体之间的长距离相互作用。然而3C技术的不足是信噪比低，来自华盛顿大学干细胞与再生医学研究所的研究人员等将芯片捕获染色体构象（4C）与大规模并行测序相结合，来绘制酿酒酵母基因组的3D图。
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8 s& N' A! W" P7 K" c/ N$ E. s6 o2 [他们的操作方法以4C为基础，首先是交联，然后是两次限制性酶切，中间还有一步分子内连接。在第二个酶切割之后，分子环化。环化后的分子含有一个6-bp的限制性酶识别位点（酶1）。与4C方法不同的是，他们用酶1重新将环状分子线性化，然后依次插入两组接头，其中一个允许用IIS型或III型限制性内切酶（例如EcoP151）消化。EcoP151消化之后，在两端就产生了相互作用的序列片段，下一步提交深度测序。0 x* J. b3 ^* T* y

* C2 j! S5 F1 f8 G; A9 [经过多个实验，研究人员终于绘制出酵母基因组的3D图。从图像上来看，酿酒酵母的基因组貌似一朵荷花，有32个染色体臂从由细胞核一个极上簇集的“着丝点”所形成的根部伸出。而12号染色体则向外延伸，被rDNA重复片段所占据，而12号染色体的剩余部分则与4号染色体的长臂相互作用。# [7 k/ B; R; r, ]5 c2 N3 G
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这张3D图是一个忽略了染色体动态性质的快照，让人们首次有机会以高分辨率一睹一个真核基因组的架构，它凸显了即便是这样简单的一种生物的基因组的三维复杂性。这张图总结了基因组结构的已知特征，从而验证了这种方法，同时又鉴定出新的特征。/ V1 `; C; _7 n! y

6 c  v$ f( I* M$ W1 Q活细胞立体成像7 V+ g! A) \$ r7 |$ L5 K

! z- t8 m5 g4 O2 m5 k$ ~) R来自宾夕法尼亚州州立大学的研究人员在进行细胞化学成分立体成像的过程中遇到了一些困难——对这些不能携带大分子碎片的化学成分进行三维成像不是件容易的事，宾夕法尼亚州州立大学的研究人员通过质谱的方法解决了这一问题，相关的文章发表在Anal Chem（80:7921–9）杂志上。- b! u5 v$ ~( ^' x0 O/ I

' z7 ]3 L* o8 r1 ~( h  w质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。1 d( R; ^/ @: u9 p6 U5 W0 n
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为了能获得优质的三维质谱成像图，Winograd教授从质谱成像的根源进行了技术修订，质谱成像技术有一个基本技术，即SIMS（二次离子质谱，secondary ion mass spectrometry），这种质谱技术是表面分析的有利工具，能检测出微小区域内的微量成分，绝对检出限10-12-10-19g，相对检出限ppm-ppb，具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量。
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SIMS用于成像早在这种技术用于生物学研究的十年前就已经开始了，比如分析集成电路（integrated circuits）中的化学成分，这种技术具有几个优点：速度快（~10,000 spectra per second），亚细胞构造分辨率（~100 nm），以及不需要基质。另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。
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Winograd教授改良了这种方法，利用一种新型SIMS光束（carbon-60 磁性球），这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。这C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”（molecular depth profiling，生物通译）。
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( z" Y# O/ I* l8 B' ?& I4 cWinograd教授研究小组利用这种方法分析了原生动物四膜虫与细胞膜弯曲有关的脂质化学物的变化情况，他说，“随着形状的改变，脂质分析的形状也发生了变化。”( E) _$ W$ a" x4 \
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C60的能量与其它的离子束相当，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60 ，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。& N( X, ]8 E- o' }3 {! n
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生物样品很复杂，对它们进行高分辨率的影像研究和化学成分分析是很有意义的事情，这项技术具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。

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