人骨髓间充质细胞培养的研究进展

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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106（2004）13-1285-03
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* C+ Z# x& x! c3 T9 m" v" V    骨髓中的细胞包括造血和非造血细胞两大类。20世纪70年代，Friedenstein等首先报道在骨髓中存在一种纺锤形的成纤维细胞集落形成单位（CFU-F），具有高度的自我更新和分化潜能［1］ 。1991年，Caplan把这些在体外能高度扩增并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC） ［2］。这类细胞通过体外培养，不仅可分化为造血实质和基质细胞，还可分化为多种类型的组织，特别是中胚层来源组织的细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞等。理论上讲，它还可以分化为所有间充质组织类型，如心肌细胞和真皮等。国外已建立了小鼠、大鼠、兔和人的MSCs系，并诱导分化出多种结缔组织，而国内大多进行的是骨髓中造血干细胞的分离、培养及用于骨髓移植，对于骨髓MSC的研究起步不久。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展，利用MSC的多向分化潜能，在组织工程、细胞因子替代治疗中以及器官移植等方面的应用研究已成为热点 ［3］ 。本文就MSC的细胞分离方法及培养条件，向各组织定向分化潜能及其生物学特性作一简要综述。+ E, y, W* N) ~8 U7 F
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    1 MSC的分离及培养" x! b6 L3 Y1 a

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    1.1 MSC的组织分布 一般认为，MSC只存在于骨髓中，但最近的研究发现，从人的骨骼肌中也分离出了MSC。它同样可以分化为骨骼肌管、平滑肌、软骨及脂肪 ［4］ 。此外也有人分别从骨外膜 ［5］ 和骨小梁 ［6］ 分离出MSC。Bethel等 ［7］ 研究发现MSC在胎儿骨髓中的含量较成人骨髓中的含量高，但在细胞形态学方面二者无差异。苏瑞军 ［8］ 的研究表明，胚胎骨髓间充质内骨干细胞较成人的幼稚，具有更强的自分泌因子以维持自身生长及分化的能力。因此常选用胎儿骨髓作为培养材料。
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    1.2 分离方法 目前用于分离MSC的方法主要有三种:（1）密度梯度离心法:根据MSC与其它细胞的密度不同，采用Percoll分离液，将骨髓细胞分为三层，取含MSC的低密度血小板层进行MSC的培养，所得细胞种类单一。路艳蒙 ［9］ 等利用Percoll分离液分离的三层细胞分别培养时，仅在上层中见有贴壁细胞生长，而其余两层未出现贴壁细胞，故证实了MSC存在于上层低密度的血小板层中。（2）流式细胞仪分选法:根据MSC细胞体积小，相对缺少颗粒的特性对它进行分选。Zohar等用流式细胞仪，从胎鼠骨膜中分离出的体积小、胞浆中颗粒少的S细胞，经培养可分化成软骨、平滑肌骨等细胞。显示可用此法可收集得自我更新和分化潜能强的MSC细胞［10］ 。但也有人认为由于这类祖细胞较为脆弱，即使不采取任何分离措施，仅仅经过流式细胞仪即可导致活性完全丢失 ［11］ 。（3）特异性单抗分离法:针对某些基质祖细胞的细胞表面标志如CD105、stro-1等，应用特异单抗结合磁性分选技术可分离某些类型的细胞。Gronthos等用stro-1单抗收集到具有多系分化潜能的细胞 ［12］ 。但目前对骨髓MSC的研究尚缺乏特异性的标志。故目前密度梯度离心法因所需仪器和试剂简单，分离所得细胞成分较单一而为多数学者采用。; R  |4 R( V7 ^
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    1.3 培养基 培养MSC学者们所用的培养基不尽相同，DMEM、F12和RPMI1640培养基都有人使用。刘晓丹 ［13］ 等用两种不同浓度的新生牛血清的底糖DMEM作培养基，发现不同浓度的血清对培养MSC纯度的影响较大。但血清浓度为10%时MSC的纯度可达95%，升至20%时，HLA-DR + 细胞亦随之升至36.1%，表明部分细胞分化为成纤维细胞，这可能与高血清浓度促使MSC分化有关。事实上，10%的血清浓度已可以满足MSC生长的需要。艾国平 ［14］ 等观察了10种不同浓度的FBS（胎牛血清）对MSC生长的影响，亦发现5%～10%的FBS浓度最适宜MSC生长，高血清浓度使细胞过早老化，反不利于干细胞的生长。付文玉 ［15］ 等选用了适合于MSC生长的专用培养基MSCGM，它利于MSC的增殖，同时抑制MSC的分化，使其8代之内均保持其未分化特性。2 T. e$ X) b0 U7 q; ?+ V# A2 ?; [
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0 f3 a6 o2 r7 o- W+ E    1.4 其他 艾国平 ［14］ 等比较了不同时间贴壁细胞的生长增殖和形态的变化，认为以选用早期贴壁———4～24h贴壁细胞进行培养最合适。他们尚比较了不同种植密度对MSC生长的影响，结果显示:在一定范围内，MTT的参入随细胞数量增加而增高，以（4～8）×10 4/ml的细胞数进行种植最利于细胞生长。路艳蒙 ［9］ 等报道在培养过程中，接种24h后，贴壁细胞数目不再增加，因此可作为换液的时间点。
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, S/ F2 g+ Q8 o1 R    2 MSC的定向诱导分化% h0 x& S' ?' S! `
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- ~2 [7 J% n1 `7 M5 H    2.1 体外的定向诱导分化 作为一种干细胞，MSC具有自身更新能力和多向分化潜能，在给予合适于不同结缔组织细胞分化的培养条件下，MSC即可定向分化。
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5 d1 ~! ?2 k$ W& p; t" K8 K    为使MSC向骨组织分化，需在培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸以及抗坏血酸盐。培养的MSC逐渐形成聚集体或小节，且碱性磷酸酶的表达逐渐增加，定量检测其活性可增加4～10倍:这种条件下培养1周后便有钙沉积的证据，且在整个培养过程中持续增加 ［16］ 。此外有证据表明，1，25（OH） 2 D 3 、转移生长因子-β（TGF-β）、IL-6、透明质酸及骨形态形成蛋白-2（BMP-2） ［17］ 均可促使MSC向骨组织分化。9 z. e4 P0 R% _! k
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    培养前需将分离出的MSC低速离心，使细胞形成细胞微团，将此细胞团加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入TGF-3即可促使MSC向软骨分化 ［16，18］ 。软骨来源的形态形成蛋白-1（CDMP-1） ［19］ 整合素 ［20］ 可促使MSC向软骨分化。可通过检测培养细胞中Ⅱ胶原的表达情况来判断MSC向软骨的分化程度。 给予1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、消炎痛时，则人MSC可向脂肪细胞分化，细胞内逐渐富集含脂丰富的小泡，这些细胞表达过氧化物酶体增殖激活受体2（PPARγ2）、脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白αP2。多种诱导处理可导致95%以上的MSC定向分化为脂肪细胞，并且脂肪泡不断地长大、融合，最终充满整个细胞。这些诱导形成的脂肪细胞在体外可健康生长至少3个月 ［16］ 。
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' G, Y) {$ {; S; L5 S* L, v0 O    在有两性霉素B存在的情况下，经5-氮胞苷处理的大鼠MSC将分化成肌细胞，继而融和形成长得多核肌管 ［15］ 。有关肌细胞和肌腱的诱导分化的方法还不成熟，有待进一步研究。$ u9 a% G8 D* t: t

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7 k( B4 @- v( N6 p! D: m' Z    另外，基础培养基、细胞密度、机械力、生长因子和细胞因子均影响MSC的定向分化。
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1 V  O- W& j2 p6 j" t$ E$ T    2.2 体内的增殖和分化 目前对MSC在体内定向分化的特定环境尚不清楚，现仅有来自动物SC的试验。有报道将犬的MSC体外扩增后，贴附在生物材料上，细胞分泌骨基质，分化成骨修补缺损的股骨骨干;兔骨髓MSC体外扩增后，与载体结合重新合成骨及软骨，用于修复软骨损伤;培养兔的MSC用于修复自体肌腱的损伤 ［21］ 。付文玉 ［22］ 等培养的人骨髓MSC注入裸鼠皮下，详细观察其生长分化情况。经过1个月的生长，在注射局部出现了由人MSC分化形成的多种组织类型:骨、软骨、脂肪、骨骼肌及肌腱样组织等结构。而且通过免疫组织化学染色显示骨骼肌纤维呈小鼠抗人actin阳性，证明这些骨骼肌纤维是由人胚胎MSC分化而来的，而非裸鼠自身的骨骼肌。从胚胎发生的角度来看，这此结构均属于来自中胚层的成分，虽然亦有类似于无髓神经纤维的结构，但还需作进一步的鉴定。
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* n' S* O# u5 c8 S    3 MSC的生物学特性' {1 m: z9 S& V+ ^/ F7 `# B
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; W* G! _! ~0 E8 N    3.1 MSC细胞表型及细胞化学特征 一般认为，MSC细胞体积小，核浆比大，不表达分化相关标志如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，碱性磷酸酶和osteopontin;在细胞贴壁附着后则细胞均一致地表达SH2、SH3（属混杂抗原）、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等多种表面蛋白 ［16］ 。但不表达造血系统的标志，包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45 ［17］ 。此外，MSC尚表达SB-10（属混杂抗原的一种）等抗原 ［23］ 。应用单抗SH2可识别骨髓MSC的一个表面抗原，经分离纯化和SDS-PAGE（蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析其分子量约90kD，并发现其是一个微循环系统发育的表面标志，在皮肤形成和血管生成中起作用［24］ 。李秀森［25］ 等应用多种与不同细胞系列反应的抗体，观察了MSC的表面抗原性标记。结果显示，MSC均一地表达CD20、CD44、CD166、和HLA-ABC，而CD34、CD45、HLA-DR及荆豆素阴性。细胞化学结果显示，细胞ANAE（细胞酸性萘酚醋酸酯酶）及PAS（糖原反应）强阳性，SB（苏丹黑反应）和ACP（酸性磷酸酶）均为阴性，提示MSC有独特的代谢特点。此外，约5%细胞ALP（碱性磷酸酶）阳性，提示细胞群体中存在向成骨细胞不同分化阶段的干细胞克隆。: h& w( X: G0 V: m/ |

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    3.2 多种细胞因子对MSC增殖的影响 李秀森 ［25］ 等人用MTT实验观察了细胞因子对MSC增殖的影响，发现INF-γ（γ干扰素）、TNF-α（肿瘤坏死因子）、SCF（干细胞因子）和IGF-1（胰岛素样生长因子）明显促进细胞的增殖，而IL-4、IL-1，bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）对细胞的生长无影响。其中INF-γ、TNF-α对增殖的刺激活性最强，结果可能提示MSC在组织修复中的重要价值。然而，它们对细胞增殖的促进作用只见于培养2天后。因此，它们可能通过间接途径起作用，即INF-γ、TNF-α刺激MSC分泌细胞因子从而促进细胞增殖。IGF-1也显示了促进MSC的增殖作用，因在原代培养干细胞和人成血管细胞的培养中亦常用IGF-1及其相关因子胰岛素，故考虑IGF-1可能是MSC体外扩增的重要因子。SCF作为一种作用于早期造血细胞的细胞因子，也加速MSC的增殖。
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) J+ R9 Q  d7 {6 Y5 W1 W    完美地修复因疾病造成的组织、肢体或器官的伤残，一直是人类的梦想及难以攻克的医学高峰。利用干细胞工程和现代生物医学技术，有可能实现这一梦想。以干细胞为代表的现代组织工程学是近两年多来迅猛发展的一个新领域。MSC无论从它的来源、分离方法及可分化的组织类型上都有其独特的优势 ［17］ 。国内外的学者们已在MSC的分离及培养、定向诱导分化及其生物学特性上作了积极的探索，并取得了一些成绩。相信人们会以它为突破口，真正使现代组织工程造福于人类。
, j$ j. t4 @* g$ E9 N) l. p5 B# p+ b

, Y+ A, z& v  _, t* o5 r. W1 C2 T    参考文献
1 g4 a  K- K, L  o" S- ?" M' e: Z7 ^1 C0 V

% P5 {  s( A% f1 G3 X    1 Feriedenstein AJ，Gorskaja JF，Kulagina NN.Fibrloblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Ewp Haematol，1976，4:267-274.
) ~, a1 F- K: e5 q9 |7 D3 o- x$ |' H/ ?  V7 ^6 Z* Q' T

7 T7 t* M% E) p5 ^! ]    2 Caplan AI.Mesenchymal stem cells.J Orthop Res，1991，9:641-650.
5 I' c% \6 j/ [! |! C3 @- N( I, E, K% e
) o, _+ t2 _8 H& M
    3 史春梦，邹仲敏，罗成基，等.骨髓间充质干细胞的研究前景.中国实验血液学杂志，2000，8（1）:61-65.
- }. k0 |3 y# i& v  z2 H) c5 c5 A; k" j- _# i/ I' y

5 j/ Y3 m! g5 a2 ?8 f    4 Williams JY，Southerland SS，Souza J，et al.Cells isolate from adult huˉman skeletal muscle capable of differentiation into multiple mesodermal phenotypes.AM Surg.1999，65（1）:22-26.
/ H- Q% v4 ]6 _+ @" ]2 J  \
2 U/ N" Z2 g5 [& S5 T
' C7 I+ j/ T* e. V5 g# R! T    5 Nakahara H，Dennis JE，Bruder SP，et al.IN vitro differentiation of bone and hypertrophic cartilage from periosteal-derived ells.Exp Cell Res，1991，195（2）:492-503.9 x5 H( f. ^. q' d8 ?
5 q; }+ R/ ?4 v

1 s; V. c9 n3 o9 W2 v; [. B    6 Nuttall ME，Patton AJ，Olivera DL，et al.Human trabecular bone cells are able to express both osteoblastic and adipocytic phenotype;implicaˉtions for osteopenic disorders.J Bone Miner Res，1998，13（3）:371-382.
0 J. p4 ?6 b% k/ g
- r3 W2 G3 {% y& I1 u. I, s" X- D% V: L; r$ E: o, y' L( z
    7 Bethel CA，Steinkirchner T，Zanjani ED，et al.Stromal microenvironment of human fetal hematopoiesis:in vitro morphologyic studies.Pathobioloˉgy，1994，62:99-103.: [0 w$ D/ j* J* y( s9 P4 R, f' J

( |$ Q3 e* P% q5 x( ~; }& ]* x2 E7 X' u8 s/ \: K$ ?; ]
    8 苏瑞军，黄绍良，周敦华，等.人胚胎骨髓基质细胞的体外培养观察.中国小儿血液，1999，4:14-15.9 k) ]2 ^* R, m; l. c
( u7 U9 T1 U, w& N8 j& F/ R% `
* c; q5 {- O& K6 ]
    9 路艳蒙，付文玉，朴英杰.人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定.第一军医大学学报，2001，21（8）:571-573.
! v/ e5 T. N" S1 q) w
3 u/ |. ~9 }: h6 [; S( S$ D4 v& Q4 [! W8 T. I, }
    10 Zohar R，Sodek J，McCulloch CA.Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry.Blood，1997，90（9）:3471-3481.
, n8 J# S1 z% \/ E( U
3 V1 \, l5 l$ `9 n$ O' U' {& |. ~: k/ y  d5 E$ E& q6 p( e7 |
    11 Deryugina EI，Muller-Sieburg CE.Stromal cells in long-term culˉtures:keys to the elucidation of hematopoietic development?Crit Rev Immunol，1993，13:115-150.$ C' y2 b+ g6 P0 u+ Q
+ X( g* d3 X3 `/ J4 r9 V9 p6 Q( |
. J. M9 u; w" B' _/ c
    12 Gronthos S，Graves SE，Ohta S，et al.The STRO-1+fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors.Blood，1994，84（12）:4164-4173.
# O2 Y) T- X+ P; z6 f8 m8 F- q
) H7 U6 }) s3 [5 w+ [
1 d! ?# H6 l0 c9 d; g& i    13 刘晓丹，郭子宽，李秀森，等.人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立.军事医学科学院院刊，2000，12，24（4）:282-284.
: N5 A( L' x; C9 G6 K$ k
2 ], @$ I* h  G# a
) W* J  e/ f1 K6 l% h    14 艾国平，粟永萍，闫国和，等.骨髓间充质干细胞的分离与培养.第三军医大学学报，2001，23（5）:553-555.( ~. U& P' f& [  Q/ D

$ `. G& y5 l! ^9 x3 W
6 W8 D8 P  {: S; w    15 付文玉，路艳蒙，朴英杰，等.人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性.第一军医大学学报，2001，21（11）:801-804.& U9 C& o  q" D- V9 U9 k

! @$ t8 @5 {  w8 |; M  C
3 p" t8 U1 X# e  K$ T0 F! s    16 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science，1999，284（5411）:143-147.9 \0 l+ s- x6 n5 \5 J

# y1 H1 g. T  ~+ Z% Y( q7 _: Z8 ]. S. u/ [4 W0 r) S, Z
    17 冯凯，裴雪涛.间充质干细胞———现代组织工程的新资源.国外医学·生物医学工程分册，2000，23（6）:325-329.+ L2 d+ P9 k- I! d2 x% L
' {) f  _: `$ v8 h' P, a
! {1 E2 b+ M7 C8 J
    18 Johnstone B，Hering TM，Caplan AI，et al.IN vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.Exp Cell Res，1998，238（1）:265-372.
; P& t* z- j/ D- ~
$ K  m! v: ?! ]) f' S, [8 ~( z" k4 Z' Y$ h, z
    19 Tsumaki N，Tanaka K，Arikawa HE，et al.Romotion of mesenchynal cell recuitment and chondrocyte differentiation.J Cell Biol，1999，144（1）:161-173.
7 N9 }0 Z9 j9 b, I! T3 q. a
3 J* K# g9 @% a( U% t: O; \/ I' v3 U. S8 L7 ]) W; x1 u: [; c' B4 m$ k
    20 Shakibaei M.Inhibition of chondrogenesis by integrin antibody in vitro.ExpCell Res，1998，240（1）:95-106.9 W+ \$ K' p8 K4 K
2 n5 C! ~3 m" B/ c. n& Z' W) C
7 x& t! P9 k4 n* e
    21 Young RG，Bulter DL，Weber W，et al.Use of mesenchymal stem cells in a collegan matrix for Achilles tendon repair.J Orthop Res，1998，16:406-413.
% y  g1 b8 E* M+ _
4 U/ r  P0 i) C( n4 ]- O
. S) I( W7 P4 C3 a0 P  t3 \. s0 |# y    22 付文玉，路艳蒙，朴英杰，等.人骨髓间充质干细胞的培养及多能研究.中华血液学杂志，2002，23（4）:202-204.  @. W, M6 ^5 B3 M8 X3 y
( y! T# p: }' b3 u) [- y& q
! I8 i1 N4 T+ n  ]# a
    23 Bruder SP，Ricalton NS，Boynton RE，et al.Mesenchymal stem cell surˉfaceantigen SB-10corresponds to activated leukocyte cell adhesion molecule and is involved in osteogenic differentiation.J Bone Miner Res，1998，13（4）:655-663." @. K' M! E2 j

  K  j7 H! H6 P9 `; ~
: g2 y4 P0 E/ ]+ B& @3 G# X    24 Fleming JE Jr，Haynesworth SE，Cassiede P，et al.Monoclonal antibody against adult marrow-derived mesenchymal stem cells recognizes deˉveloping vasculature in embryonic human skin.Dev Dyn，1998，212:119-132.4 Y& m; y% P8 B3 M

; l0 l* `) G% w6 ]$ C- {: V- b9 c% B' E0 y8 m$ K
    25 李秀森，郭子宽，杨靖清，等.骨髓间充质干细胞的生物学特征.解放军医学杂志，2000，25（5）:346-348.
6 Z- Z6 |6 y; n/ N- W" a5 S- Q* @' u, l

8 k3 C3 P* M. r. P: A) t    作者单位：650032云南昆明医学院第一附属医院血液科