人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用

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人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用*★○
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王培蕊1, 2，马学玲1，王心蕊3，文佳媚1，陈柏竹○4，刘亢丁1
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1吉林大学第一医院神经内科，吉林省长春市 130021；2北京市大兴区人民医院神经内科，北京市 102600；3吉林大学人兽共患病教育部重点实验室，吉林省长春市 130021； 4 Division of Business and Finance, Utah University, 8600 Old Main Hill, Logan Utah, USA
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王培蕊★，女，1979年生，吉林省九台市人，汉族， 2006年吉林大学第一医院毕业，硕士，主要从事脑血管病研究。
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通讯作者：刘亢丁，教授，主任医师，博士（后），硕士生导师，吉林大学第一医院神经内科，吉林省长春市 130021
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国家自然科学基金资助项目(30470588)** |: ^1 @& q' v- P  ?5 h2 w
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中图分类号:R743 文献标识码:B
5 a  T4 y0 u& R$ _+ t% T; R文章编号:1673-8225
1 X% e: h1 a9 D% H(2007)46-09250-052 f  p, U% R: X; Y5 J+ ]) P

" S' t6 b4 X) n4 a收稿日期：2007-07-24
2 l# z" O( z( a, N% Q. A( e: m! T修回日期：2007-08-316 T' z  G4 k8 W. U9 F; y
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Expression of hepatocyte growth factor in lipopolysaccharide stimulated skeletal muscle satellite cells7 f* I6 j3 p0 Y& f7 V

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Ａｂｓｔｒａｃｔ
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ＡＩＭ: Nowadays the study on human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) differentiating into endothelial cells is less. This study will isolate and culture human MSCs, then investigate the induced differentiation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in vitro through VEGF165 transfection.
4 H1 P1 h0 E5 |- ?) {9 u: \& T6 lＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was conducted from April 2005 to April 2006 at the Key Laboratory of Zoonoses，Ministry of Education，Institute of Zoonoses，Jinlin University. Fresh bone marrow obtained from healthy donor volunteers were isolated and cultured by Percoll gradient centrifugation. The cellular morphology and growth were observed under inverted microscope. When the MSCs reached to approximately confluence, they were passaged and proliferated by monoclonal culture. Immunophenotypes of MSCs were detected by flow cytometry techniques. pcDNA3.0-VEGF165 plasmids were duplicated, amplified and extracted, sublimated in prokaryotic cell of Bacillus coli DH5α. MSCs were transfected by means of lipofectamine media method. Immunophenotypes of cells were detected by flow cytometry techniques after the transfection. Taking the idling plasmid cells group and the non-transfection cells group as the control group, then immunofluorescence staining was employed to accredit the transfection. 3 F# w4 M" S$ l6 B
ＲＥＳＵＬＴＳ: After one week of primary culture of MSCs, the hematopoietic cells disappeared, the adherence cells increased and showed on fusiform shape, stretched out gross cell process. After two weeks, MSCs confluenced to monolayer. Fusiform ecphyma became longer. The arrangement of MSCs took on evidently directionality, such as vortex, reticulate and radiat. The immunophenotypes of MSCs were positive for CD44, CD29, but negative for CD34, CD31, CD45. After VEGF165 transfection, the expression of CD44 was drastically decreased and CD31 increased. The immunofluorescence staining was shown that the antibodies to VEGF labeled by FITC made MSCs show green and CD31 labeled by cy3 made MSCs show red.) h: E/ W9 |! m/ \- T0 t

/ X( W! A4 o2 a. ?# R6 xＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:The immunophenotypes of MSCs transfected by means of lipofectamine media method changed obviously. The expression rate of CD31 increased obviously. The cells took on the character of phenotype of endothelial cells. This expressed that the MSCs had the potency to differentiate into endothelial cells.
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Wang PR, Ma XL, Wang XR, Wen JM, Chen BZ, Liu KD.Differentiation-inducing effect of vascular endothelial growth factor on isolation and culture of human bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(46):9250-9254(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-46/46k-9250(ps).pdf]
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摘要
" [$ R7 k2 \  F$ E$ \7 g! q目的：目前有关骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化的研究较少。本实验分离和培养人骨髓间充质干细胞，用带有VEGF165的质粒转染人骨髓间充质干细胞，探讨血管内皮生长因子对其体外诱导分化的作用。/ z+ u+ D! Q& l8 N* J
方法：实验于2005－04/2006－04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成。取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓（自愿提供），采用Percoll梯度分离培养骨髓间充质干细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。原代细胞培养至增殖接近融合状态时，单克隆培养法分离传代培养，扩增骨髓间充质干细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫学表型。在原核细胞大肠杆菌DH5α中复制扩增和提取，纯化、克隆pcDNA3.0-VEGF165质粒。用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞。应用流式细胞术检测诱导后骨髓间充质干细胞免疫学表型变化。并采用免疫荧光染色鉴定转染情况，并设质粒空载和未转染的骨髓间充质干细胞为对照。 , ]* p/ s5 a4 s* D) K7 S* u, C" n
结果：人骨髓间充质干细胞原代培养1周后，造血细胞消失，贴壁细胞体积增大，呈现梭形外观，有粗大的细胞突起伸出。2周后细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显的方向性，细胞排列成旋涡状、网状、辐射状。流式细胞术显示，人骨髓间充质干细胞免疫学表型CD44、CD29阳性，CD34、CD31、CD45阴性。VEGF165诱导骨髓间充质干细胞后CD44表达明显降低，CD31明显升高。免疫荧光染色显示，用FITC标记后的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，用cy3标记的CD31抗体使细胞显现了红色荧光。
$ P) K7 C# J+ h" ~2 Q$ \. E4 o- A/ d! A结论：转染后的骨髓间充质干细胞细胞表型发生明显转变，CD31表达率明显增高，呈现典型的内皮细胞的表型特征，这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能。5 \, k+ E( J6 h. d0 |
关键词：骨髓间充质干细胞；血管内皮生长因子；脑缺血；基因转染& d1 K, W. G$ ^
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王培蕊，马学玲，王心蕊，文佳媚，陈柏竹，刘亢丁.人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(46):9250-9254 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-46/46k-9250(ps).pdf]
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0 引言
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目前，研究缺血性脑损伤的治疗包括两大方面：缺血半影区血循环的恢复；神经组织的修复、再生，结构与功能重建。而缺血、缺氧环境的改善是神经修复再生的前提条件，因此，只有两方面兼顾才有可能从根本上治愈或减轻缺血性脑损伤。骨髓间充质干细胞被发现以后，多数的研究集中在利用干细胞来进行神经修复、再生的研究上[1,2]，而干细胞移植后有否向血管方向分化及利用干细胞来重建脑缺血区的血循环的研究却被相对忽略了。本实验旨在通过分离培养扩增骨髓间充质干细胞，并转染带有血管内皮因子的质粒，使转染后的骨髓间充质干细胞向着内皮细胞诱导分化。为缺血性脑血管疾病的干细胞移植和基因治疗提供新思路。- D/ G4 u1 |# X# M; C; u. t- E

4 a  z9 w/ G# z( p1 材料和方法2 G2 E: V+ K2 b' e: x9 j2 p

$ L3 b4 p. V  M) y6 U8 X设计:观察对比实验。
. T. b, ~% [* M9 u. z) k4 [2 @单位:吉林大学第一临床医学院神经内科。- @1 j  N3 |; Y2 a: Z6 W0 u
材料:实验于2005－04/2006－04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成。以成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓（由吉林大学第一临床医院门诊患者自愿提供）为实验标本。主要试剂与仪器：L-DMEM培养液（Hyclone），胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），胰蛋白酶（北京三泰兴隆科技有限公司），Percoll分离液（北京夏斯生物公司），鼠抗人CD44，CD29，CD34，CD31，CD45单克隆抗体，鼠抗人VEGF抗体（武汉博士德公司），质粒提取试剂盒（Promega），梭华－sofast转染试剂盒（太阳马生物工程有限公司），pcDNA 3.0-VEGF165质粒（吉林大学公共卫生学院放射生物科实验室惠赠），CO2孵箱（日本SANYO公司），FACScan流式细胞仪（美国Becton Dickinson）。
$ L7 {( o& I" ?4 w! ~; c- B2 y" I设计、实施、评估者：实验的设计、实施及评估为全体作者，且经过正规系统培训。0 a" a1 Z4 {1 F5 W
方法：
9 ^( b' X3 d- c8 H, b人骨髓间充质干细胞的原代培养：取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓约 5 mL，加入等体积的含10%胎牛血清的L-DMEM培养液充分混匀后，以1 200 r/min， 8 min离心，收集沉淀。应用密度梯度分离法即加入等体积浓度为1.073 g/mL的percoll液，然后将收集的沉淀加到Percoll细胞分离液上。操作时注意要将沉淀浮在细胞分离液之上，不要沉入细胞分离液之下。以2 500 r/min，离心30 min使细胞分层，吸取白雾状的单核细胞层，加入适量含10%胎牛血清的L-DMEM的培养液，混匀，然后将其接种于24孔板中，每孔加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM细胞培养液至2 mL，置于 37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养箱，饱和湿度条件下培养。
' r5 O, J; h: r# T9 K; K7 M骨髓间充质干细胞的传代培养：原代细胞培养增殖至接近融合状态时（长满培养孔的80%），用0.25%胰蛋白酶300 μL滴入培养板消化细胞约2～3 min，并在倒置显微镜下观察，细胞出现边角隆起，收缩，体积变小，还尚未完全脱离板壁时，加入含胎牛血清的培养液中止消化，并用吸管轻轻的吹打培养板，使细胞脱壁完全悬浮起来，并按照1∶3的比例，将细胞分别至于3个培养孔内，加入适量的含体积分数为0.10的胎牛血清L-DMEM的培养液，继续培养。; L- v2 U8 V6 f& L5 u
骨髓间充质干细胞表面抗原测定前准备和测定：用0.25%胰酶消化收集生长状态好的第3代骨髓间充质干细胞，用PBS液（pH 7.2，0.01 mol/L）洗涤2次，以1×106个细胞与（PE标记）抗CD44、CD29、CD31、CD34、CD45抗体（浓度均为1∶30）在4 ℃孵育50 min，用PBS液（pH 7.2，0.01 mol/L）洗涤2次，悬浮在0.01 mol/L PBS中，用流式细胞仪检测其蛋白变化，各组均作相应的阴性对照，即以PBS代替一抗。% r- ?! c% ?8 i4 j# N2 T1 n
骨髓间充质干细胞的体外血管内皮生长因子基因转染：由大连宝生物工程有限公司对该pcDNA3.0-VEGF165质粒进行测序（见图1），测得质粒上载入的目的基因共576个碱基与基因Bank上查得的VEGF165基因序列完全相符，证实该质粒上连接的目的基因确为VEGF165后。在原核细胞（大肠杆菌DH5α细胞）中复制扩增和克隆化pcDNA 3.0-VEGF165质粒。将5 mL转化了pcDNA3.0-VEGF165质粒的菌种于含有氨苄青霉素的500 mL LB培养液中继续培养，并提取和纯化。转染步骤：转染前1 d，将生长良好的细胞用0.25%胰酶消化1.0～2.0 min，吸出胰酶，用含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基吹打细胞成单个细胞，将细胞悬液转移到新24孔培养板中，每孔1× 105个细胞，每孔加入2 mL完全培养液。37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养18～24 h。转染当天取细胞地行形态观察，准备转染。将 60 μL梭华－sofast/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀混合。放置37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵育箱孵育48～72 h。加入2 mL含浓度为500 mg/L G418的10%FBS新鲜培养液，继续培养。并在倒置显微镜下观察转染后的细胞。7 @5 M$ U7 X& u5 @3 _% m7 L
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转染了VEGF165基因的骨髓间充质干细胞免疫学表型测定：实验步骤同转染前的细胞免疫学表型测定方法。0 ~* c: R) m$ B
免疫荧光染色鉴定：设3个组进行免疫荧光染色：即质粒空载骨髓间充质干细胞组，转染了pcDNA3.0-VEGF165的骨髓间充质干细胞组，和未转染的骨髓间充质干细胞组。将这3组细胞爬片用蒸馏水水化20 min，0.1%TritonX-100作用10 min，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3次，3%内源性过氧化物酶阻断20 min，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3次，血清封闭30 min，滴加一抗VEGF（1∶50）4 ℃过夜，在振荡器上用0.1 mol/L PBS冲洗 5 min×3次，滴加FITC标记的二抗，常温避光反应30 min，在振荡器上用0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3次。用甘油封固，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。将转染了pcDNA 3.0-VEGF165的骨髓间充质干细胞组应用上述同样方法水化，阻断，封闭后，滴加一抗VEGF和CD31（1∶50）在4 ℃下共同孵育过夜，洗涤，滴加FITC标记的VEGF二抗和cy3标记的CD31二抗，常温避光反应30 min，在振荡器上用0.1 mol/L PBS冲洗后用甘油封片，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。/ d; t- J! F. R) F+ {3 e6 m
主要观察指标：①细胞培养形态学观察。②细胞免疫学表型与免疫荧光染色结果。
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8 s& l9 y1 D( h* V2 l/ C* s2.1 原代细胞培养形态学变化 原代细胞接种培养最初，培养物中造血细胞成分居多，随着培养时间的延长，悬浮的造血细胞逐渐坏死破碎，随着换液次数增加而被清除。接种的 24 h内，体积较大的单核细胞完成贴壁。48 h后贴壁的细胞开始分裂增殖。细胞呈现成纤维细胞梭形外观。1周后造血细胞基本消失，贴壁细胞体积增大，仍呈现梭形，有粗大的细胞突起伸出，有些细胞呈现三角形或多角形，核居中，有一二个核仁。2周后细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显的方向性，细胞排列成旋涡状、网状、辐射状，见图2。
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9 c% }. }3 k! ^& y( L' z# E; ~5 D+ X7 ~2.2 转染前骨髓间充质干细胞免疫学表型测定结果 CD44(73.90%)、CD29呈阳性，以CD44阳性率最高。CD34、CD45、CD31(4.37%)呈阴性，鉴定结果与本课题组先前研究结果一致，见图3。9 h) g* V- m( m, r  W5 }% R1 A8 I
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4 ?/ n* p& G! h" s2.3 转染pcDNA3.0-VEGF165后骨髓间充质干细胞培养形态学观察 转染后细胞形态由原来梭形、多角行渐变为细胞突起变短成扁圆形、圆形或椭圆形，但仍然呈集落状生长，集落间渐成上皮细胞样铺路石样结构生长。4 K: D. ]% R% Y5 h# j3 z
2.4 细胞免疫荧光染色鉴定 用FITC标记的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，说明转染了pcDNA 3.0-VEGF165后的骨髓间充质干细胞可表达血管内皮生长因子，见图4，5。用cy3标记的CD31抗体使细胞显现红色荧光，说明转染了 pcDNA3.0-VEGF165后的骨髓间充质干细胞的细胞表型发生变化，表现了内皮细胞的表型即CD31，两个抗体共同孵育时，细胞即有绿色荧光又有红色荧光，说明转染pcDNA 3.0-VEGF165后的骨髓间充质干细胞既具有内皮细胞表型同时又可表达血管内皮生长因子。
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8 C; o+ _4 Q5 A2.5 转染pcDNA3.0-VEGF165后骨髓间充质干细胞免疫学表型测定结果 经流式细胞仪分析：CD44表达明显下调(41.67%)，CD31则明显上调(58.12%)，骨髓间充质干细胞 呈现典型的内皮细胞表型，见图6。; j1 j0 w! x6 B+ e9 a+ a3 O' ]. W% o
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3 讨论
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- L. W. }/ K& n) B1 g3 I. z细胞治疗和基因治疗是近年在医学研究中比较热门的领域，由于干细胞是一类未分化的细胞，具多向分化潜能，因此其广阔的临床应用前景受到了学者们关注。成人骨髓干细胞主要分为两大类，一类以CD34阳性为代表的造血干细胞，另一类是以CD34阴性为主的骨髓间充质干细胞[3]。其中，骨髓间充质干细胞起源于早期中胚层和外胚层，是一类具有高度异质性和我向分化潜能的多能干细胞[4,5]。且来源广泛，取材分离培养较为容易，体外扩增能力强，可分化为多种造血以外的组织，并易于外源基因的转染和表达，因而被认为是细胞治疗和基因治疗理想的靶细胞。9 r" X/ u8 `9 d& B
骨髓间充质干细胞培养法较多，目前大多数研究者以密度梯度离心结合贴壁培养，取得相对理想的分离纯化的目的[6]。此外，还有全骨髓培养法、流式细胞仪分选法及磁珠分离法。流式分选过程中的机械剪切力和高能激光可能造成骨髓间充质干细胞的损伤，影响其生物学特性。磁珠分离法也因骨髓间充质干细胞尚无特异性表面标志而较少采用。本实验采用的是简单易行的密度梯度分离法，并将Percoll分离液的密度调至1.073 g/mL，获得的细胞均一性较好[7]。以往的诸多报导中，关于培养骨髓间充质干细胞的培养基较多，如MSCGM，α-MFM，L-DMEM等，关于胎牛血清的浓度也有10%，15%，20%等不同，本实验采用的是报导中最多且效果较好的含10%胎牛血清的L-DMEM来作为培养骨髓间充质干细胞的培养液。因为血清浓度过低不利于细胞的生长，而高浓度血清则易引起细胞分化，影响其生物学特性，使细胞过早老化。实验证明，应用此浓度的培养基，细胞生长状态良好，可传数代而无明显衰老迹象，同时也进一步验证了密度梯度分离法这一经典的培养方法。由于骨髓间充质干细胞没有特异性表型，大多数鉴定骨髓间充质干细胞仍主要依赖其形态水平、功能特征并通过培养过程中出现的分化表型来推断是否为骨髓间充质干细胞[6]。可用酶细胞化学法和免疫细胞化学法，前者是检测细胞的ALPase活性，ALPase为成骨细胞的标志酶，骨髓间充质干细胞应为阴性，可证明其并未向成骨细胞分化，但这一鉴定方法，并无特异性。后者即为检测细胞膜的抗原，用表面抗原排除法来鉴定。Pittenger等[4]证明人类骨髓间充质干细胞可以统一地（> 98%）表现为缺乏CD14、CD34、CD45；表达CD29、CD44、CD90。它高表达CD44，CD44是透明质酸和骨桥蛋白（成骨特异蛋白）等几种配体的受体。由于CD29和CD44有阳性表达，而这些抗原是造血干细胞表面所没有的，CD34和CD45作为造血干细胞的表面标志抗原则呈阴性表达，这说明了培养的细胞不是骨髓中另一大类细胞即造血干细胞而是骨髓间充质干细胞，同时，由于CD31为内皮细胞的特异性表面标志，骨髓间充质干细胞应为CD31阴性表达。
* K7 R( G. s- @5 q4 V% j( s5 z$ z目前，国内外学者对骨髓间充质干细胞的组织工程学应用研究较多，多将骨髓间充质干细胞诱导分化为骨、软骨、脂肪等组织细胞，体外构建工程化软骨相继成功[8]，而对于骨髓间充质干细胞的内皮分化功能研究较少。血管内皮生长因子为内皮细胞的有丝分裂原,可刺激血管内皮细胞分裂和增殖，增加细胞外基质，诱导血管发生。但是由于血管内皮生长因子生物半衰期短，疗效短暂，人们开始考虑应用血管内皮生长因子基因转移治疗。
8 M0 r" _3 ?- X! m1 V* M+ x/ e结合骨髓间充质干细胞和血管内皮生长因子的众多优点，在心脑血管缺血性疾病中临床应用中有重大的意义。有相关实验研究和报导证实，骨髓间充质干细胞植入鼠的脑缺血模型体内后，其可通过血脑屏障 [9，10]，并且优先向缺血的皮质迁移和聚集[11]，发现移植后缺血脑组织中生长因子的增加和细胞替代作用对神经功能的恢复起到了重要作用[12，13]。有研究证实脑缺血时缺氧诱导血管内皮生长因子及其特异性信号受体的功能性上升性调节[14]，并可发挥神经保护作用，刺激神经起源和脑血管生成。本实验同期相关报道表明，转染血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植可改善兔心肌梗死后的心功能，其疗效明显优于单纯骨髓间充质干细胞移植及血管内皮生长因子基因治 疗[15] 。用构建有血管内皮生长因子真核表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞后效增加血管内皮生长因子表达，并表现出较强的促内皮细胞增殖作用[16，17]，注射大鼠急性心肌梗死模型，结论提示基因转染移植能显著促进缺血心肌血管再生，进而改善心脏功能[17]。
8 `# X. D0 \# r; c常用的基因转染方法主要为脂质体介导、腺相关病毒介导、反转录病毒载体介导等。有相关报道提示采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多[18]。转化生长因子β3基因重组腺病毒载体可成功构建并在骨髓间充质干细胞内的表达 [19]。本实验选用脂质体为载体，该类载体与目前常用的病毒类载体相比无毒性和致癌等危险，因此更有利于进一步体内研究，但因骨髓间充质干细胞表面缺乏特异性受体，转染率较低。
* V! l( R/ z* N+ _! L, {4 d本实验用带有VEGF165基因的质粒采用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞后发现，转染后的骨髓间充质干细胞表型发生明显转变，CD31表达率明显增高，呈现典型的内皮细胞的表型特征，这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能。用带有荧光标记的VEGF抗体与转染后的骨髓间充质干细胞共同孵育后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察，发现细胞显示绿色荧光，说明转染后的骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子。这就为血管组织工程学提供了良好的种子细胞，在缺血性疾病和器官缺损疾病的治疗中发挥作用。关于骨髓间充质干细胞如何高度纯化，是否有足够的数量和潜能，是否有致癌性，明确其自然凋亡过程，如何有效地控制骨髓间充质干细胞的定向分化及各类基因转染骨髓间充质干细胞方法的稳定性及效率等问题仍需进一步探讨和解决。5 v( \: D* Q7 n: _/ s
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4 参考文献
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张俊克

好文章，谢谢

baichunyu

好东东

kejia0422

恩，挺不错的文章