蛋白质设计超小型表观遗传编辑器，单个AAV递送，实现体内持久表观基因编辑

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张锋最新论文：蛋白质设计超小型表观遗传编辑器，单个AAV递送，实现体内持久表观基因编辑
# U$ `- m/ `1 D0 _# ?7 |来源：生物世界 2025-05-10 14:11; [1 i- F( e3 m$ }) F# @
该研究通过整合直系同源物筛选、进化和结构引导相结合的蛋白质工程方法、RNA 工程以及基于深度学习的结构预测，对 IscB 蛋白及其向导 RNA（ωRNA）进行工程化改造，从而生成了NovaIscB。
/ i9 L& m- g6 b* F# m, Z张锋团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Evolution-guided protein design of IscB for persistent epigenome editing in vivo 的研究论文。7 W; X0 \: N: ]$ y! @; u
该研究通过整合直系同源物筛选、进化和结构引导相结合的蛋白质工程方法、RNA 工程以及基于深度学习的结构预测，对 IscB 蛋白及其向导 RNA（ωRNA）进行工程化改造，从而生成了NovaIscB。- E# I$ Y4 L  y' A
这一紧凑型基因编辑工具 NovaIscB 在人类基因组上实现了高达 40% 的插入/缺失编辑活性（效率相比野生型 OgeuIscB 提升约 100 倍），并且相对于现有的 IscB 具有更高的特异性。该研究进一步证明，NovaIscB 可与甲基转移酶融合，从而创建一个可编程的表观遗传编辑系统——OMEGAoff，其紧凑程度足以被装载到单个腺相关病毒（AAV）载体中，可在体内实现持久的基因抑制（持久抑制 PCSK9 基因表达，显著降低胆固醇水平，效果持续超过 6 个月）。 6 d% I* W$ W( E& H% P$ q$ d0 P
更重要的是，该研究提出的结合进化和结构引导的蛋白质工程方法，为优化蛋白质功能提供了一个新框架，其潜在应用远远超出了基因组编辑的范畴。
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Cas9 的祖先：IscB 的先天优势与短板 0 ~) Z4 [$ m" A6 a2 f& [) N
在基因编辑领域，如何将基因编辑器精准且高效地递送到体内特定的组织/器官，始终是一项重大挑战。& j1 N. f( f. u  m  Q( B( B
2021年9月，张锋团队在 Science 期刊发表论文，发现了一类广泛的转座子编码的 RNA 引导核酸酶，并将其命名为 OMEGA 系统（包括IscB、IsrB、Tnp8），它们同样使用一段RNA（ωRNA）来指导切割 DNA 双链。4 \& t  S) b2 Q5 e) `1 y" q( q7 }- o# e
其中，IscB 被认为是 Cas9 的祖先，更重要的是，IscB 非常小，大约 300-550 个氨基酸，仅为 Cas9 的约 30%，这意味着它们可被开发为新的小型化基因编辑工具，从而更容易被递送到细胞内。6 c5 _3 K5 F/ ?# b, V) y
但原始的 IscB 存在三大硬伤：' Q& W' L3 a4 N! j" P3 D$ n
1、有效向导RNA 长度仅 13bp，导致特异性较低，易脱靶，与之相比，Cas9 的有效向导RNA 长度为 17-20bp；- M9 @. F3 H7 f) ~
2、编辑效率不足野生型 Cas9 的 1%；
. z# j7 X6 @3 d$ h* z3、无法适配复杂的表观遗传编辑工具。
" I( z6 g  a( A: ?  D# C进化指导的智能改造：四步打造基因魔剪
3 S1 N7 b9 h* G" O张锋团队采用“自然筛选+人工智能”的创新策略，通过四个关键步骤重塑 IscB：
; l0 }. I$ Z4 \" q" i. b1、自然宝库筛选
1 H6 n. D/ V3 j+ A' c( E2 ^从 144 种 IscB 天然变体中，发现源自人类肠道微生物的 OrufIscB，其编辑效率比前代提升 5-10 倍。
# f$ K: u/ R9 R" Z5 B% m+ W2、结构嫁接
+ T% p  }1 ^( n( c2 T$ |, ~将 Cas9 的 REC 结构域（负责识别和结合目标 DNA 序列）精准移植到 IscB，将有效 引导RNA 长度延长至 20bp，脱靶率降低 3 倍。) H$ K) {# J" O, {
3、定向进化1 B1 Z" u/ P% Q* M: a2 D
通过深度突变扫描，筛选出关键位点E137K/E409R/I533K，使编辑活性再提升 2 倍。
! k' l9 Z4 s& I0 ]4、RNA工程
  y: k& b$ d& K9 a8 K精简向导RNA 结构，将其从 225nt 缩短至 166nt，使人类细胞中的向导RNA（ωRNA）表达量提升 4 倍，适配化学合成递送。7 G9 u. a2 ~& _+ M, v, Z
通过这四个步骤，张锋团队创造了 NovalscB 系统：
, p3 p4 {9 w( ]9 K+ J, d•        编辑效率达 40%，媲美传统 Cas9；7 O# l6 V: k4 J9 Q) h+ j
•        特异性与 SpCas9 相当，远超同类小型化基因编辑工具；
" ]0 y' e2 ]0 l•        整个系统尺寸（IscB蛋白 + gRNA）仅 614aa + 166nt，轻松装入单个 AAV 病毒。
- y! h: F: q5 {* e! g+ d0 ~4 e更重要的是，NovalscB 系统还可进一步用于构建碱基编辑器和表观遗传编辑器。
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: P0 u* R; A* M9 f; l3 U体内持久编辑：改写表观基因编辑的新可能' M8 B: |. \4 J: b8 B0 a1 N) ~
张锋团队进一步将切割活性丧失的 NovalscB 与甲基转移酶融合，构建了表观遗传编辑器——OMEGAoff 系统。 & ]  ^. Z" Q! ?/ E/ h1 D6 [
研究团队使用单个 AAV 载体包装 OMEGAoff 系统，通过静脉注射递送，靶向编辑 PCSK9 基因，结果显示，从注射后 3 周开始，小鼠血清中 PCSK9 蛋白水平显著降低，从注射后 4 周开始，小鼠血清中胆固醇水平显著显著下降，降低幅度与使用 PCSK9 单抗的临床效果相当，这些效果稳定持续到实验结束（6 个月）。为了评估 OMEGAoff 系统的毒性，研究团队在实验结束时检测了血清总胆红素和丙氨酸氨基转移酶水平，未观察到显著变化。这些结果突显了使用 OMEGAoff 进行持久基因抑制和表观基因组编辑的潜力。
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总的来说，这项研究通过进化和结构引导的蛋白质设计，研究了 1000 多种变体，从而创建了 NovaIscB 以及基于 NovaIscB 的表观遗传编辑器——OMEGAoff 系统，为基因编辑以及表观遗传编辑工具箱提供了有前景的新工具。该研究提出的结合进化和结构引导的蛋白质工程方法，为优化蛋白质功能提供了一个新框架，其潜在应用远远超出了基因组编辑的范畴。: y/ a5 ~. o- }1 I5 {# O, _

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