关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

cicadacjk

yamanaka第一篇文章中的iPS有很多是重编程不完全的，直到用Nanog-GFP(2007 Nature)作为reporter后，所得到的iPS细胞才大多数完全重编程。
& u; W/ s* Z9 O7 a' v所以06的文章中，只有少数的几株细胞被用来做最后的验证，比如你这张图，yamanaka在原文中就指出所得到的细胞多数并不好，后来在TTF的iPS中也只有几株比较好，有一株形成了13.5天的嵌合体。你引用的western图，是拿这几株细胞做的。此外，甲基化结果也证明yamanaka那些克隆Oct4启动子未曾完全地脱甲基化。之所以会有这种不完全重编程的情况出现，和当时用的是Fbxo15-neo的细胞是有关系的，实验表明Fbxo15在重编程的前几天就开始表达，它自己本身也不是核心的多能性基因，因而筛选出半桶水是非常正常的。: z+ O) q* U& Q' W' [& |' Z, p
而在现在的技术条件下，用Oct4-GFP或者Nanog-GFP作为reporter，得到的iPS细胞系90%以上都可以形成存活的嵌合体。分辨内源激活层面的重编程已经不是难题。9 Q6 |& X6 O' p( v' m

" q. s+ N- ^$ ^; P& z% G半定量PCR的假阳性问题是很正常的，使用定量PCR可能会更好一些。此外，在南京模式动物中心就有OG2小鼠出售，如果想iPS好挑一些，建议还是用这种小鼠的MEFs做实验吧。如果你没有这种小鼠，可以同时感染GFP病毒（假设你用的是逆转录病毒），这样你专门挑GFP沉默的克隆，效果也很好。

cicadacjk

回复 15# 上海过客 6 h5 P8 J0 h( M4 b* n, W
, V. T1 h/ r! S/ O0 L4 Q+ V
当时yamanaka的研究经费是很少的，选择较为廉价的方法也很正常，况且半定量做图的好处就是一目了然，有时候即便我有定量结果，也会倾向于用半定量放在主figure中。5 }$ B/ X8 K5 o2 g9 N8 c
GAPDH做内参没什么问题的，如果你实在信不过，再加个18s，你就相信了。

cicadacjk

回复 19# 上海过客 0 |0 D, x7 ]& K

! O  `/ J6 [0 L9 Z+ j- y5遍还是很难完全看懂的，我刚进实验室至少也看了10遍
+ F2 G3 E  i* a" N4 R做完一年实验回头看，发现当时其实只看懂了一点9 u9 q1 W; E! \7 e
还是要多看其他文章，开始盯他的文章，学到的只是鉴定的技术