急！原代培养，细胞消化打散后碎片太多！

SVZ

急！急！急！我是做成体神经干细胞培养的新手，取的是10周小鼠的SVZ组织，第一次做细胞培养时细胞消化打散的还凑合，但是后来做了几批都是细胞碎片超多，用的是0.25%胰酶消化30min，每隔10min打散5-10次。离心1000rpm，3min.刚开始用的是无血清培养基终止消化，后来用的是加了血清的培养基终止消化，后来又换用玻璃吸管打散，手法尽可能的轻，但还是有很多碎片。& }0 q# v- X) I- s: S8 q% y( d

" \5 _4 x" }$ G& U7 Q$ ~( |  |请各路高手给予指点，不胜感激！

zhmgeneral

神经干细胞本来就很脆弱，估计是酶消化过头了。还有，我们都是直接用血清来终止消化，而不是带血清的培养基~

sxjcsq2010

调整一下胰酶浓度和消化时间吧。如果你的手法已经尽可能的轻，就是胰酶的事儿了。

是鸟就要去飞

我不太了解神经干细胞，0.25%胰酶，你的消化要30分钟？？？求解

norther817

建议换成0.125%或胶原酶，胰酶消化10-15min是足够的了
/ z. @4 D, d4 P8 o9 n& R+ F- ?- \& ]
含10% 血清培养基科加到5倍胰酶体积来终止消化

圆圆850

胰酶浓度太高，我们一般用0.025%，时间就10分钟，你消化过了应该是

双刀

楼主可以考虑将你的0.25%胰酶进行稀释，然后再使用。可以考虑稀释成0.125%。另外，消化时间不要太长，免得死太多的细胞。

afei198520

可以稀释酶浓度之后再试试，30分钟似乎时间有点长，稍微的调整一下酶解的时间，楼主的细胞碎片很多肯定是消化不好的原因，时间偏长，而且还有离心，细胞经受不住啦

SVZ

谢谢！非常感谢朋友们的关注和回复！
4 L* ~9 l; h  a4 P0 O我最近还做了一批胎鼠的脑神经干细胞培养，培养的效果很好，消化：0.25%trypsin，15min，离心1000rpm，3min.现已出现了大量神经球，状态很好，基本没有碎片。这应该可以排除我试剂的问题。应该还是组织特异性的原因. 申明一下，我做的是10周小鼠的SVZ干细胞培养。
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. O0 k, s8 c& F9 {2 q从理论上讲，10周的小鼠比胎鼠的组织更难消化，所以胰酶的消化时间应该长一些。而且，我也尝试了缩短胰酶消化时间，减少吹打次数，但是还是以失败而告终。而且我查了很多文献，发现各个文献的差异都比较大，这让我很费解。我的感触是，细胞培养没有金标准。8 c  w4 Z) l; x1 {! Q

* M7 K" J2 c3 g- y/ ?现在，我准备换用TrypLE消化液（invitrogen的一种trypsin替代液）试用一下。我会向大家汇报结果的。

SVZ

在问大家一个小小的问题，你们打散细胞都用什么东东？
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我们这边大家普遍用进口的1ml枪头。
8 H, R# R) o8 m+ h如果用玻璃吸管的话，多大为宜？