体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:50 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：司煜安，许文荣，严永敏，钱晖，朱伟，周忠海，徐静，周洪兴，曹慧玲，李继刚作者单位：江苏大学医学技术学院；附属医院临床检验中心，江苏镇江 212013

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      【摘要】  目的：探讨人骨髓间质干细胞（MSCs）在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞。方法：分离培养人骨髓间质干细胞，采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式，在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达，免疫组织化学染色检测肝细胞标志。结果：在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2，3-双加氧酶（tryptophan 2，3-dioxygenase，TDO）基因表达阳性，CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高；第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白（ALB）、肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）、肝细胞特异性抗原（HSA）和CK18表达阳性。与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO。结论： HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞，可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源。 3 H0 t7 ^2 _" L( r
      【关键词】骨髓间充质干细胞；肝细胞；细胞分化
   ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30471938）；卫生部科研课题（WKJ2005-2-024）；江苏省医学领军人才资助项目；江苏省自然科学基金重点资助项目（BK2007705，BK2007092）；镇江市重点实验室资助项目（SH2006066，SH2006070）；江苏省高校自然科学基金资助项目（06KJD310040）: p9 I3 U! w% P4 K* a

　　　　Differentiation of human mesenchymal stem cells derived from　bone marrow into hepatocyte-like cells in vitro  c0 a$ [" u. _

　　SI Yu-an,XU Wen-rong,YAN Yong-min,QIAN Hui,ZHU Wei, ZHOU Zhong-hai, XU Jing,ZHOU Hong-xing, CAO Hui-ling, LI Ji-gang
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8 B4 ?2 p: c: ~

　　(School of Medical Technology; Center of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital,Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013,China)

　　［Abstract］Objective: To explore whether human bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)are able to differentiate into hepatocyte-like cells under appropriate condition in vitro.Methods： The human bone marrow MSCs were isolated and cultured. The MSCs were induced by HGF，bFGF and co-cultured with damaged mouse liver tissues. The specific genes of hepatocyte were detected by RT-PCR and real-time PCR in different culture period. The hepatic markers were identified by immunofluorescent staining.Results： The expression of AFP,CK-18 and TDO until day 7 were detectable and increasing after prolonged culture. After 7d of inducing, CK18,albumin,AFP,HNF and HSA positive staining was observed in differentiated cells using immunohistochemistry. AFP and TDO were detected in cells co-cultured with damaged liver tissues of mouse separated by a transwell membrane for 21 days.Conclusion： Human bone marrow MSCs were able to differentiate into hepatocyte-like cells and may serve as a source of cells for cell therapy of hepatic diseases.. D3 Y- t' ]) P$ S

　　［Key words］mesenchymal stem cells ; hepatocyte ; differentiation

　　肝移植是终末期肝病有效的治疗手段,由于肝源的缺乏,使得一部分患者在等待中死亡；而对于肝干细胞体外分离培养方法、肝细胞再生及其在肝脏损伤修复中的作用都尚待进一步的研究［1］。因此,寻求非肝源性干细胞并促其向肝细胞定向分化是亟待解决的重要问题。近年来，干细胞分化潜能的研究及成体干细胞可塑性概念的提出使成体干细胞的研究进入重新审视与发展的阶段，干细胞多向分化潜能已成为当今组织细胞工程与再生修复研究的热点。骨髓干细胞作为成体干细胞的一种，因其取材方便等特点受到广泛关注，早期的研究表明,骨髓干细胞能向肝细胞分化［2～4］。这些研究为寻找非肝源性干细胞提供了新的思路和策略。5 U! F0 j1 ?$ C7 ?5 e4 _" |
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　　近年来的研究表明，骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有多向潜能的细胞，在特定诱导条件下可分化为骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞及肝细胞等［5,6］。同时MSCs免疫原性低,可通过多种途径抑制同种异体免疫排斥反应,并且克服了使用胚胎干细胞和胚胎肝细胞治疗的伦理学问题,成为以干细胞为基础的肝病治疗的更好选择［7］。MSCs的上述优势引起了科学工作者对MSCs向肝细胞分化潜能的广泛关注。Sato 等［8］将人MSC，CD34 及非MSC/CD34- 3种细胞群移植给急性肝损伤的大鼠,观察到MSCs是分化为肝细胞的主要成分。Lee 等［9］使用制瘤素M(oncostatin M, OSM)及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)诱导人MSCs分化为成熟肝细胞。Saji 等［10］观察到碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)能提高小鼠骨髓细胞向肝系细胞分化效率。Jang等［11］将大鼠造血干细胞与肝损伤大鼠的肝组织液共培养，细胞表达肝转录因子和成熟肝细胞标记。因此，本实验使用HGF联合bFGF共同诱导人MSCs向肝细胞分化，并将分离纯化的MSCs置于模拟肝损伤的微环境中，即与小鼠损伤肝组织共同培养，检测MSCs的分化方向和特征，为利用MSCs治疗肝脏疾病提供实验依据。
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　　1材料和方法
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　　1.1实验试剂6 t% N/ j2 y; G7 a8 i
, K% q4 m3 X1 _) r6 K: T7 O
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　　L-DMEM培养基(Gibco公司，BRL)、胎牛血清(Gibco公司，BRL)、1.077 g/ml Ficoll 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)、Trizol试剂（Invitrogen）、RT-PCR成套试剂盒(Promega)，HGF(Prepo TECH.INC)，bFGF(Promega)、鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体、鼠抗人CK-18 单克隆抗体、鼠抗人白蛋白单克隆抗体、鼠抗人HNF单克隆抗体及鼠抗人HSA单克隆抗体、羊抗小鼠IgG，DAB显色试剂盒(博士德公司)、胶回收试剂盒、T-A克隆试剂盒（Invitrogen）7 e( ?& \7 `* R1 I

　　1.2主要设备

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　　超净工作台(苏州净化厂)、二氧化碳培养箱（3110，美国Forma公司）、激光共聚焦显微镜（Radiance 2100TM，美国Bio-Red公司）、倒置式生物显微镜（TE300，日本Nikon公司）、PCR仪(Eppendorf公司，德国)、荧光定量PCR分析仪（Corbett Research公司，澳大利亚）、凝胶成像分析系统。5 |1 V9 j% [( S5 f: ~# _" ^

　　1.3方法

　　1.3.1MSCs分离培养及纯化取自怀孕4个月以上的正常孕妇意外流产胎儿股骨，按Wakitani等的方法略加改进：取骨髓约3 ml，肝素抗凝，经1.073密度Ficoll分离，DMEM培养液洗涤3次后，以5105单个核细胞/ml接种于50 ml培养瓶中，每瓶含5 ml完全DMEM培养液（完全DMEM培养液为DMEM培养液中含青、链霉素100 U/ml，100 ml/L 胎牛血清、50 ml/L 马血清，0.25 μg/ml两性霉素)。置5%CO2、饱和湿度、37℃CO2培养箱培养。3 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3天换液1次。大约培养10 d左右，贴壁细胞形成融合层，用0.25%胰蛋白酶（用1 mmol/L EDTANa2 配制）消化，按1∶3的比例再次接种传代，当这些细胞生长接近融合层时，即得到胎儿骨髓MSCs。用流式细胞仪鉴定其细胞表面标志［12］。

　　1.3.2体外MSCs定向肝细胞样细胞的诱导分化取培养至3～5代的人MSCs,消化后以105个/ml接种到6孔板中,次日换液,改用添加有20 ng/ml HGF和10 ng/ml bFGF DMEM 培养基进行诱导分化,每3天换液1次。

　　1.3.3MSCs与损伤小鼠肝组织共培养将培养到3代的MSCs移入Transwell板的下层培养，每孔细胞密度为105 个/ml。取昆明小白鼠，按10 μl/g的剂量腹腔注射以植物油溶解的10％CCl4，16 h后检测肝功能指标有变化后，手术取出肝组织剪碎铺于Transwell板的上层共培养。21 d后收集细胞提取RNA进行RT-PCR。

　　1.3.4RNA的提取、RT-PCR于培养的第0，7，14，21 天分别收获被诱导分化培养的细胞,调整细胞浓度为5106 个/ml，用Trizol试剂提取细胞总RNA,逆转录为cDNA, RT-PCR检测CK18、甲胎蛋白和色氨酸2,3双加氧酶(TDO)的表达(按试剂盒说明所标记的方法进行)。RT-PCR引物序列见表1。PCR反应总体积为25 μl∶5 μl，反转录产物为模板,上、下游引物各0.5 μl, dNTP 2 μl，缓冲液2.5 μl，Taq聚合酶0.2 μl，加水至25 μl。将扩增的RT-PCR 产物电泳成像。
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　　表1CK18，αAFP，TDO，GAPDH基因的引物序列（略）
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　　Tab 1PCR primers of CK18，αAFP，TDO，GAPDH gene% n! V, f+ }# M* V
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　　1.3.5实时定量PCR使用T-A克隆试剂盒，分别将纯化后的PCR产物CK18(376 bp)，TDO（493 bp）基因片段和GAPDH片段(262 bp)连接入pGEM-T载体，转化入DH5α感受态菌，筛选阳性克隆，扩菌后，纯化提取质粒，PCR鉴定阳性质粒。用Eppendorf Biophotometer(Eppendorf公司，德国)测定质粒浓度(M为基因片段长度)，按照公式C10-9/2(M 3000)324.56.021023(copies/μl)计算质粒数，稀释为109～103梯度浓度，测定并绘制标准曲线。反应体系为25 μl，包括：10定量PCR缓冲液2.5 μl，cDNA模板2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μl，MgCl2(25 mmol/L)3.0 μl，引物各0.5 μl(10 pmol/μl)及40 U定量Taq聚合酶，Sybergreen(1∶1 000稀释)1.5 μl，BSA 1 μl,用ddH2O补足至25 μl。为了避免引物二聚体的干扰，使用4步法。
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　　1.3.6细胞免疫组织化学染色诱导培养0，7，14， 21 d 时消化诱导细胞制备爬片，PBS 冲洗3 min 3次,用75%甲醇室温固定20 min, PBS 冲洗3 min 3次，分别加入抗HNF(1∶400 稀释)、抗白蛋白(1∶50 稀释)、抗CK-18(1∶50 稀释)、抗甲胎蛋白(1∶50 稀释)、HSA一抗(1∶50 稀释)抗体,置于37 ℃水浴箱孵育1 h,PBS 冲洗2 min 3次；加入生物素化山羊抗小鼠IgG，置于37 ℃水浴箱孵育20 min,PBS 冲洗2 min 3次；滴加SABC，置于37 ℃水浴箱孵育20 min，PBS 冲洗5 min 4次。使用DAB显色试剂盒，1 ml蒸馏水加试剂A，B，C各1滴，混匀后滴加至爬片，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。3 q+ O9 n" G- U; |$ C2 `
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　　1.3.7统计学处理t检验统计分析，P- x. w3 q0 w" O: H

　　2结果
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　　2.1细胞形态学观察0 S+ _2 l; S" `5 b" B$ a

　　MSCs接种于培养板, 细胞呈圆形, 透亮。24 h后,MSCs开始缓慢分裂、增殖,少数细胞开始贴壁生长。半量换液后见贴壁细胞形态呈梭形,典型成纤维细胞样外观。第3天后细胞增殖加快,呈团簇集落样生长,中心细胞分布较密,外周细胞呈放射状向外分布。贴壁细胞增多,呈成纤维样细胞形态,细胞大且扁平，无立体感。7～10 d 各个细胞克隆增大,直至铺满培养板底面达到融合状态。使用HGF和bFGF共同诱导21 d,与未加生长因子的对照组相比，没有观察到细胞形态的明显变化，细胞仍呈长梭形并相互交织。
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　　2.2细胞生长因子诱导后肝细胞特异性基因检测结果' s5 [% ?- I. |2 Q' R2 r) v0 J% H
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　　在MSCs诱导培养0 d 时显示AFP和TDO基因表达均呈阴性,CK18呈弱阳性。第7天出现AFP基因表达，第14天表达增强，第21天表达减弱；第7天出现TDO基因弱表达，而后持续增强；CK18在第14天时有强阳性表达（图1）。而未加生长因子的对照组,各时段均未检测到肝系细胞标志的表达变化。
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　　2.3实时定量PCR结果
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　　定量PCR显示，与未诱导MSCs比较，细胞因子诱导后的MSCs CK18在诱导后第7天表达量明显增加，第14天和第21天后表达减弱。而TDO的表达量在第7天和第14天时增强，到21天时表达量最高，经过分析，具有统计学意义（图2）。该结果与“2.2”RT-PCR 结果基本一致。/ t, ~* p& q. z& b: Y  A% j0 s: s; l
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　　1：空白对照组；2：阳性对照组；3：非诱导组；4：诱导7 d；5：诱导14 d；6：诱导21 d； M：DL20000 h. ?6 O( k% l% @6 _3 `

　　图1人骨髓间质干细胞经HGF和bFGF诱导后肝细胞特异性基因的表达（略）/ S% b4 }' h  `- t4 D& m1 _% @
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　　Fig 1Expression of hepatocyte specific genes in mesenchymal　stem cells induced by HGF and bFGF8 h% X4 ~$ m) B  r& b

　　A：荧光定量PCR检测诱导后骨髓间质干细胞 CK18的表达变化；B：荧光定量PCR检测诱导后骨髓间质干细胞 TDO的表达变化*：P

　　图2荧光定量PCR检测HGF和bFGF诱导MSCs CK18和TDO的表达变化（略）% O8 D. l  B6 R5 ?
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　　Fig 2Real-time PCR for expressions of CK18,TDO gene　in mesenchymal stem cells induced by HGF and bFGF
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　　2.4细胞生长因子诱导后MSCs细胞免疫化学染色结果

　　AFP，CK-18，HNF，HSA诱导0天时均未见表达，白蛋白弱表达。诱导后第7天时白蛋白和AFP高表达，而后持续增强；CK-18，HNF，HSA在第7天时弱表达，第14天时呈阳性表达，随着诱导时间的延长，阳性表达增强（图3）。5 m  c% P* X) c7 T! f0 z5 x; V! Q6 H

　　2.5MSCs与损伤小鼠肝组织共培养后肝细胞特异性基因的表达

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　　共培养21 d后，MSCs显示AFP和TDO均呈阳性，而未与损伤肝组织共培养的细胞以及与正常肝组织共培养的细胞肝系细胞标志AFP和TDO表达均为阴性（图4）。
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　　1：AFP阳性对照； 2：TDO阳性对照； 3，4：空白对照； 5：AFP阴性对照； 6：TDO阴性对照； 7：共培养21 d细胞AFP表达； 8：共培养21 d细胞TDO表达； M：DL2000& ^7 O# s' y: y0 P! V
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　　图4MSCs与损伤小鼠肝组织共培养后肝细胞特异性基因的表达（略）

　　Fig 4Expression of hepatocyte specific genes in mesenchymal　stem cells co-cultured with damaged mouse liver tissues$ @1 k) L" V/ W5 Z9 X

　　3讨论
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　　目前，肝组织工程的首要问题和关键因素是寻找来源充足并有稳定的肝特异性功能的种子细胞。成熟肝细胞具有诸多不足，如获取肝细胞难度较大、异基因肝细胞可能产生免疫排斥反应、体外培养易失去活性与功能等，因而不能成为满意的治疗细胞。MSCs具有干细胞的共性即自我更新和可塑性，在一定条件下具有可向不同类型组织细胞分化的潜能，而且自人骨髓中提取的方法相对简单且获取数量较多，易于培养与扩增；可以来自患者自身,免疫相容,无排斥反应；在体内尚有在靶器官部位旁分泌VEGF，bFGF等细胞因子的作用［13］ ;最重要的是多次传代后仍保持基因稳定［14］。这使得MSCs有较大的临床应用价值。由于尚缺乏MSCs的特异性表面标志物,目前常用分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选法和流式细胞仪分选法。本实验中采用密度梯度离心法对骨髓细胞进行初步分离,获得单个核细胞,并根据MSCs呈贴壁生长特性用反复贴壁法使其纯化,所获细胞纯度高,实验结果稳定,为进一步研究其生物学特性、功能奠定了基础。

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　　近期研究表明，在特定条件下，MSCs可以被诱导分化为肝系细胞［15，16］。但是对于诱导分化的条件，目前尚未发现比较理想的统一方法，寻找一套高效、理想的诱导条件已经成为目前研究的热点。HGF被认为是胚胎发育过程中与内胚层发生有关的因子［17］。此外,在部分肝切除和急性肝衰竭患者的血清中可检测到急剧升高的HGF水平,这提示HGF在肝脏发生中发挥重要作用。Oh等［18］将大鼠新分离的骨髓细胞在体外用HGF诱导分化为肝细胞。Yamazaki等［19］将小鼠骨髓细胞用肝衰竭患者血清、OSM、HGF诱导分化为肝细胞。Schwartz等［20］从人、大鼠、小鼠的骨髓中分离得到MSCs的亚群，FGF-4单独或与HGF联合就可诱导其分化为肝细胞，先后表达不同分化时期的肝细胞标志，并具有成熟肝细胞的功能，能分泌尿素，具有细胞色素P450的活性, 可以摄取低密度脂蛋白, 合成糖原等。Lee等［9］设计先后应用HGF和制瘤素M两步实验诱导hMSCs分化为肝细胞。最近,一些研究者应用HGF，OSM或FGF-4诱导脐血源性MSCs分化为肝系细胞［21,22］。而bFGF是一种毛细血管增殖刺激剂,具有广泛的生物活性,可影响细胞的黏附、增殖和分化,不仅能提高MSCs的增殖速度及其寿命,且能在增殖过程中保留MSCs的多向分化潜能［23］。

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　　因此, 本研究采用含有HGF和bFGF的培养体系共同诱导MSCs向肝细胞分化。在本次研究中,我们用PCR和定量PCR观察到MSCs明显的肝细胞特异性基因AFP，CK18，TDO的表达变化，分化的细胞用细胞免疫化学染色能检测到肝细胞特异性标志如白蛋白，甲胎蛋白，CK-18，HNF和HSA的表达。白蛋白由肝脏合成，各种原因所致的肝脏疾病均可引起其浓度的下降。甲胎蛋白是胚肝标记，是由未成熟肝细胞合成、分泌的一种蛋白，在成熟肝细胞中表达下调。CK-18是肝细胞成熟特异性表面抗原。肝细胞核因子HNF对肝细胞分化调控起关键作用，在肝脏内高表达并调节肝细胞众多功能基因特异性表达。HSA是肝细胞特异性抗原。故本实验采用这5种抗体检测MSCs向肝系细胞诱导分化的情况。结果表明, 诱导分化的MSCs第7天表达甲胎蛋白,提示该诱导细胞具有早期幼稚肝细胞的标志。随着诱导时间的延长，细胞同时表达其他肝细胞标志如CK-18、白蛋白、HNF和HSA，并逐渐增强，提示在该诱导体系中具有不同分化状态的肝细胞样细胞并且诱导细胞逐渐成熟。8 \* w; i0 X1 P2 C. S' v
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　　为了证明体内肝损伤条件下MSCs分化的情况，本研究采用分离纯化的MSCs与CCl4损伤的小鼠肝组织以Transwell共同培养，互不接触但因子可以相互交流。这种联合培养的方法诱导MSCs分化，充分利用了肝急性损伤的微环境条件来研究其对MSCs分化的诱导作用。诱导后细胞的肝特异性基因的表达提示，在损伤肝组织环境中，MSCs可分化为肝细胞样细胞。* k* s2 u+ Q8 j( t& j) A; B
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　　综上所述,本研究采用HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤的肝组织共培养的方法所诱导的细胞在基因和蛋白质水平上不同程度表达肝系细胞特异性标志。说明在HGF和bFGF的联合诱导下，MSCs向肝细胞样细胞分化，而且MSCs在肝损伤组织的诱导下也同样具有定向分化为肝细胞样细胞的特性。虽然MSCs体内外诱导分化为肝细胞样细胞的机制还有待深入的研究，但本研究的结果为MSCs应用于肝脏疾病或肝损伤修复治疗提供了新的思路和策略。

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　　（本文图3见彩色插图）（略）  l8 f' |+ z! s7 j) W
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