Cell：超越天然蛋白的束缚——从头设计"罗丹明结合蛋白"Rhobin

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Cell：超越天然蛋白的束缚——从头设计"罗丹明结合蛋白"Rhobin，集六种理想特性于一身，实现75°C极端活细胞成像+ c: S2 m7 `5 U$ a4 w- q
来源：生物谷原创 2026-09-07 14:37; c. h" f) T$ i6 G2 f- M) F2 _
在一项新的研究中，研究团队描述了一种用于从头设计高稳健性配体结合蛋白的计算策略，这些蛋白能识别一系列相关配体。
4 ~+ }0 I* v1 R蛋白质工程——即利用天然蛋白质作为蛋白质设计的起点——已提供了大量工具，彻底改变了他们对生物学和治疗学的理解。例如，工程化蛋白质标签被广泛用作细胞和组织成像中的荧光标记。荧光蛋白（FPs）已从天然绿色荧光蛋白及其同源物进行了广泛工程化改造，这些蛋白可自发氧化形成发色团。结合天然荧光团（如黄素和胆绿素）的蛋白质也被工程化为标签，以克服FPs成熟缓慢和光谱范围有限的缺点，尽管其配体通常具有次优的亮度和/或光稳定性。另一种策略是将酶工程化为自标记标签，如HaloTag和SNAP-tag，它们共价结合带有荧光团的底物。尽管有这些进展，但工程化天然蛋白质耗时费力，并受限于起始蛋白质的内在局限性。例如，现存的亮标签与生活在极端条件下的生物（如嗜热菌）不兼容，因为天然蛋白支架在高温下不稳定。相比之下，从头设计绕过了起始天然蛋白质的演化印记，使人们能够在初始设计中定制具有所需特征的新工具。+ n0 M6 s' ~+ Z8 j

: k% {9 F# w: R. M# Q* N' h在一项新的研究中，研究团队描述了一种用于从头设计高稳健性配体结合蛋白的计算策略，这些蛋白能识别一系列相关配体。他们专注于为荧光显微镜结合荧光团，尽管该方法在其他需要设计对配体家族共享关键特征具有极高特异性、同时赋予分子其他部分广泛特异性的蛋白质的应用中也应有用。该项目始于几位生物学家向蛋白质设计师提出挑战，要求创造一种荧光标签，以满足现有蛋白质工程工具未能满足的成像需求。# V' s$ @1 K2 O; J/ `
他们对从哺乳动物细胞到嗜极生物的成像应用所期望的"理想特性清单"包括：（1）高亮度和光稳定性，具有单分子灵敏度；（2）对荧光团家族具有广泛特异性，特别是远红发射和荧光发生的；（3）可逆结合，用于光子密集型成像中的延长成像持续时间；（4）比FPs和HaloTag更小的尺寸；（5）极端热稳定性，以提供第一类用于研究嗜极生物的标签；以及（6）与现有标签的正交性，用于多路复用测量（图1A）。虽然已有结合锌卟啉和FP发色团类似物等荧光团的从头设计蛋白被报道，但它们尚未被广泛用作荧光标签，因为它们缺乏其中一些理想特性。因此，他们旨在设计结合罗丹明衍生物的蛋白质——罗丹明是一类广泛使用的小分子荧光团，正不断被优化以获得更优性能。他们的目标是设计泛罗丹明结合蛋白，既着眼于现有罗丹明衍生物，也着眼于未来研究中可能被设计的衍生物。/ `' }* Y# d) X; C. `4 y5 Z8 o* Q
罗丹明在非荧光的内酯（L）形式和荧光的两性离子（Z）形式之间处于平衡状态，其中内酯转化为一个极性的羧苯基——他们选择它作为罗丹明结合蛋白设计中的关键元素。内酯与开环羧酸盐之间的平衡常数K_L-Z决定了重要的性质，如生物利用度和荧光发生性（图1B）。L形式是非荧光的，而开环羧酸盐则发出明亮的荧光。在此，他们开发了一种计算策略，特异性地靶向一系列罗丹明衍生物中的极性荧光羧苯基和氧杂蒽部分，同时容忍染料分子其他部分——这些部分经常被改变以表现出适用于不同应用的理想荧光特性——的取代（图1B）。
2 s/ S  ~. Q8 y0 Q- d" Z7 p该策略实现了高实验成功率——测试的9条序列中有8条表现出对靶标罗丹明的强效结合。通过识别荧光所需的极性官能团，他们获得了能紧密结合主要以荧光Z形式存在的亮罗丹明衍生物，以及在与结合时被"点亮"荧光的荧光发生性罗丹明的蛋白质。所得蛋白质是高度稳定的荧光标签，在一系列任务中表现出优越的性能，包括常规、超分辨和单分子显微镜。此外，其极端热稳定性使得能够在75°C的活体条件下对嗜热物种进行荧光成像——这是当前工具无法处理的。/ f" L% H* E/ l4 Q, y' @% v0 i6 K

$ c: {8 ~! t4 l! H天然蛋白质的工程化已提供了大量用于探测和操控细胞过程的工具，突出例子包括FPs、酶促自标记标签和配体结合支架。这些成功通常依赖于广泛的定向进化来识别赋予新功能或改进功能的突变。然而，天然蛋白质并非总是"可进化的"，而向多种期望功能进行工程化则更具挑战性。从头蛋白质设计提供了一种替代方案，从第一性原理出发创造具有定制形状和功能的蛋白质，不受演化历史的约束。虽然从头蛋白质及其进化变体已实现了令人印象深刻的功能范围，但它们的功能表现往往落后于从天然蛋白质迭代工程化而来的那些。与最先进生物工具的直接比较还很有限。此外，同时包含与天然蛋白质组件相当的多种特性也属罕见。
0 c: }9 }8 Z1 `' w- K' o在此，他们展示了如何通过在从头设计过程中将期望的功能特征转化为结构约束，将六种理想特性融入从头设计过程。凭借完全定制的蛋白质支架和序列，他们实现了包含所有六种理想特性的Rhobin的从头设计。引人注目的是，通过测试不到一打序列，他们识别出了活性设计，其性能与经过多年迭代工程化精炼的广泛使用的天然蛋白基标签相当或更优。此外，Rhobin卓越的热稳定性将其实用性扩展到天然标签无法企及的领域，实现了在75°C下对嗜极生物的活细胞成像。! {' r5 }$ M, j6 Q" Y- j
对于细胞成像，Rhobin具有几个优点，使其成为要求苛刻的成像方法（包括超分辨和单分子成像）的强大标签。（1）它们与多种罗丹明的兼容性使研究人员能够从不断增长的、具有定制特性的探针工具箱中选择合适的荧光团。（2）其17 kDa的小尺寸约为广泛使用的HaloTag和最近报道的可逆HaloTag系统的一半。（3）其在细胞系统中良好的归一化亮度归因于一个定制的、封装的罗丹明结合口袋。（4）具有可变亲和力的可逆结合允许用户在产生更高峰值亮度但交换速率较慢的染料和通过更快染料交换维持更长信号的染料之间进行选择。（5）Rhobin卓越的稳定性使得在75°C下对嗜极生物进行成像成为可能，为极端条件下的研究提供了工具。（6）由于选定的罗丹明可低成本获取，Rhobin代表了一种相较于当前蛋白质标签更易获得的替代方案。（7）他们选择JF660作为设计靶标，但该流程可直接应用于不同荧光团以进行定制化应用。综合这些优势，他们认为Rhobin，连同其他近期工程化和设计的罗丹明结合物，为开发面向应用的荧光标签和生物传感器提供了理想基础——类似于GFP和HaloTag的引入如何彻底改变了该领域。' y( B. S% S( s( m" X
他们对Rhobin的设计和应用将从头蛋白质设计推进到超越概念验证的阶段，使得创造具有一组预定义期望特性的蛋白质成为可能——每一种特性都达到或超过了现有方法的性能。这样一套综合性的理想、高活性特性的实现，在设计和天然蛋白质中均属空前。他们预期，他们的方法将为面向苛刻生物应用的下一代蛋白质工具打开大门，扩展细胞成像及更广泛领域的能力。
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虽然本工作中使用的罗丹明已针对光物理性质和生物利用度进行了优化，但染料对某些亚细胞结构（特别是线粒体）的弱非特异性结合在不同程度上仍被观察到。作为罗丹明染料本身的固有性质，这种非特异性背景也存在于其他基于罗丹明的标签中，包括HaloTag。虽然Rhobin比现有HaloTag系统更小，因此可能减少对标记蛋白质的扰动，但不能完全排除对天然蛋白质结构或功能的潜在影响。例如，他们观察到当H2B-Rhobin以过高的水平过表达时，会错误定位至核仁。（生物谷Bioon.com）( o- N: i7 v5 t6 H' A, c. _
参考文献：
0 K- \- n# D. ^! X% N2 I! u4 XYuda Chen et al, De novo pan-rhodamine binders for fluorescence microscopy from mammalian cells to extremophiles, Cell (2026). DOI: 10.1016/j.cell.2026.08.007.
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