细胞转染

huijinyu621

有哪位前辈给俺讲讲细胞转染啊 不明白原理 不明白目的 谢谢啦 万分感谢

lixiaodong

简单说来就是通过载体携带核酸进入细胞中。常用的如CaPO4法，简易实用，但对有些细胞系效率低。不同
( D, A2 V) X- g4 `细胞的转染可能尤其最适的方法。脂质体方法也较常用，如Lipofectamine及Fugene等。可参考其说明书。分子克隆书中: I7 x1 v8 t. \# E* i
有一章讲这个问题，到文献区搜索下载看看。附上CaPO4方法的一篇Nucleic Acid Res文章，探讨转染成败的影响因素。
6 w9 }# N- G6 u' j8 U- W CaPO4.pdf (104.99 KB)

2010-7-12 16:10 上传

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huijinyu621

呵呵 谢谢前辈

huijinyu621

回复 2# lixiaodong % Q+ _1 u/ e$ i; Z& i
) T5 k' u4 w! \
2 V* y2 O& `; [7 {' L9 E
    谢谢前辈 呵呵

show0ji3

我们实验室用的是电激转染，G418筛选，听说也有用脂质体做的，也是用G418筛选，不过后者没有见过。

cony

9 }$ `1 ?: o  d6 g$ T% H# f6 e/ o
显微注射法是目前最常用的转基因方法，其核心技术是利用显微操作仪将外源DNA注射到受精卵原核，待其发育为桑椹胚或囊胚后移入假孕母鼠，即可获得转基因小鼠。
: c* h2 T( w8 r0 u+ m. q     病毒转染，该方法的原理是逆转录病毒感染细胞后，其RNA反转录为DNA前病毒，依赖整合酶及其末端特异性核酸序列，DNA前病毒可以整合到染色体上,此法一般获得的是嵌合体小鼠，而且外源基因的整合往往是多个位点的，因此子代的遗传形状可能完全不同。# b( V; R* |2 o/ P1 D
     电穿孔法,将供体细胞与受体细胞，或外源DNA和细胞混合，悬浮在缓冲液中，在高压电场作用下，受体细胞膜出现瞬间可逆性穿孔，外源基因借此进入细胞内。2 z6 o4 u* y- p9 ~" w
    精子载体法主要技术路线是将外源基因与活精子共同孵育，通过精子摄取外源基因，体外受精，获得小鼠。/ U  |: d1 f$ G3 g# y
    磷酸钙和DNA片段共沉淀转染法，此法机理为DNA与磷酸钙形成沉淀物，通过细胞的胞饮作用进入细胞质，然后进入细胞核，DNA再整合到染色体上而实现外源基因的转移。+ v' u9 M$ N+ I5 ~
   脂质体（liposome)是人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转动到细胞内。其优点是包在脂质体的DNA可免受细胞DNA酶降解

懵懂干细胞

回复 1# huijinyu621 ) P3 x& B% e. F0 I. i. g+ ^
(一)磷酸钙转染技术# Z! G* p4 u  F% ?
( m' ?3 x1 T1 L' f( G
是由Graham等于1973年首创，实验室中转染哺乳动物细胞最广泛使用的方法。其原理是借助形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获，其中的一部分可被整合到染色体中。该方法可以适用于外源DNA的瞬间表达和稳定表达。其中瞬间表达一般转染后48-60小时即可，而稳定表达则要先进行18-24小时的选择培养，然后传代作选择培养到所需的细胞克隆出现为止。
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* O3 A1 }7 n0 H& H' m(二)DEAE-葡聚糖转染方法
& {/ I0 Q4 X! l( g+ x) `. N8 c! \! t$ B
二乙胺乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，即DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)是一种高分子量的多聚阴离子试剂，最初用于促进脊髓灰质炎病毒、SV40和多瘤病毒导进细胞，后发现，经调整以后可广泛用于转染病毒或带病毒序列的质粒。其促进细胞捕获DNA的作用机理不明，可能与DEAE-dextran和DNA形成复合物后抑制核酸酶对DNA的降解有关，也可能是DEAE-dextran与细胞结合引发了细胞的内吞作用。- q5 ]- \2 W6 c9 A% o; r3 u

& B$ e& ^1 \8 u% z4 W(三)电穿孔转染技术
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8 g$ j1 Q. _: Q  A- \+ J. i9 y* N电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，导致不同细胞间的原生质膜发生融合作用的过程。电穿孔也可以促使细胞吸收外环境中的DNA分子，在微孔开启期间，外面的DNA分子可以进入细胞，最终进入细胞核内。1982年Wang等首先利用电穿孔技术成功地把外源DNA导入小鼠的成纤维细胞。该技术由于操作简单，转染效率高而被广泛应用，几乎所有的细胞都可以使用此技术。电穿孔技术转染的DNA可以是线性的(主要用于稳定表达)，也可以是环状的(主要用于瞬时表达)。
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/ x! O! d; p. s2 G  _0 u(四)基因显微注射技术0 ?9 F/ a+ a6 B2 q$ j' S' q

2 d4 E0 Y2 c5 s8 N, z* _是一种直接使用显微注射仪，把重组DNA注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核中的方法。显微注射法所采用的细胞一般是单层帖壁细胞，该方法条件便于掌握，如果操作得当，可以获得相当高的转染效率。显微注射技术是转基因动物技术中将基因导入哺乳动物细胞的主要方法之一。! c9 Q: l5 F/ M( Z) V, O
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(五)脂质体载体法
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: E6 w' {" e5 X# e( R+ T+ _  y+ I- I脂质体于20世纪60年代被发现，是一种人造类脂膜，最初是被当作细胞膜的模型来研究的。脂质体可以包被药物而用作肠道外药物投放系统，此外，脂质体还可以包装DNA。制备包装DNA的脂质体，一般应用逆相蒸发(reverse phase evaporation)技术，用此法可以产生大型的包装高效DNA的单层脂质体载体。以SV40进行研究表明，与裸DNA相比，包装成脂质体后其转染效率提高100倍。
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' R8 z9 f7 _( B* S& X: `) a1 e1 w6 e除以上介绍的方法以外，还可以使用基因枪的方法转染重组DNA进入哺乳动物细胞。导入动物细胞的DNA，可以借助与其相连的病毒DNA游离于细胞的染色体之外，进行复制和表达，也可以整合于染色体的DNA之中，随细胞繁殖的过程进行表达。

xujie158

这个问题我想还是这样说吧：
) ^4 D' C4 U8 A) `0 G首先转染的话，一般根据你的实验目的可以分为：瞬时转染和稳定转染。
( O  p2 L+ n. G7 Z! P瞬时转染一般是通过脂质体、PEI、磷酸钙、电击等这些化学和物理的方法将质粒导入细胞中，使外源基因得以表达，这样的转染效率一般可以达到70%以上，但是这种瞬时转染细胞只能够适应短期的基因功能的研究，培养的时间稍长外源基因也就丢失了，而且瞬时转染不同的操作手段等产生的转染效率也存在差异。$ a6 z! @. D# s% @0 p7 x
这样，就需要有一种能够稳定表达外源基因的细胞系，来适应我们研究外源基因的要求，这种细胞系能够稳定传代，不同研究者操作重复率也较高，这也就是稳定表达的细胞系。$ Y! a: O% Y) H
稳定表达细胞系的构建也是通过瞬时转染将质粒导入细胞，然后在G418压力作用下，细胞逐渐纯化，最后只有稳定表达外源基因的细胞了。这种稳定细胞系在以后培养过程中一般都需要在培养基中添加G418，以使细胞特性不发生改变！

yueyongheng

转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
. y- v- t2 Z, L" c& [8 j理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
) g2 Z$ \8 g9 ~5 a2 H需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。