猕猴骨髓干细胞动员后外周血干细胞、免疫细胞亚群及细胞因子变化 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:02 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：潘兴华*, 庞荣清, 和占龙, 王蕙仙, 张步振,  赵熠作者单位：成都军区昆明总医院临床实验科, 云南昆明 650032; 中国医学科学院昆明医学生物研究所, 云南昆明 650118


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      5 p0 m) A, l; f  j( o8 `
      9 ]; a, V  A- W

      【摘要】  　　目的: 观察GMCSF动员猕猴骨髓干细胞后外周血干细胞、免疫细胞亚群和细胞因子含量的动态变化, 为临床干细胞动员及用于治疗疾病提供参考依据。方法: 健康猕猴连续5 d, 皮下注射GMCSF 8 μg/(kg·d), 分别于0、 2、 4、 6、 8、 10 d采集外周血, 血细胞分析仪计数白细胞(WBC)总数、淋巴细胞和中性粒细胞比例, 流式细胞术（FCM）测定CD34 、 CD133 、 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD56 细胞比例, 酶联免疫分析法测定血清TNFα、 IL1β、 IL2含量。结果: WBC、中性粒细胞、 CD34 、 CD133 细胞数量和比例均同步升高（P0.05）, IL2浓度升高幅度较大并至少持续至第10天（P
      【关键词】猕猴干细胞动员免疫细胞亚群细胞因子
   　　The changes of stem cells, immune cells and cytokines in peripheral blood after marrow stem cell mobilization in macaqne/ G+ c+ v7 U. ~% e# P* U

　　PAN Xinghua*, PANG Rongqing, HE Zhanlong, WANG Huixian, ZHANG Buzhen, ZHAO Yi

　　The Department of Clinic Experimental, Kunming General Hospital of Chengdu Military District of PLA, Kunming 650032; The Animal Center of Medical Biology Institute, Chinese Academy of Medical Science, Kunming 650118, China9 L" t- Y4 U1 [! J/ _
! `1 s. L& K8 a2 P
　　[Abstract]AIM: To explore the changes of white blood cells（WBC）, neutrophils, stem cells, immune cells and cytokines after marrow stem cell mobilization by GMCSF in macaqne. METHODS: Macaqne were injected with GMCSF 8 μg/(kg·d) for 5 days. The ratio, number and subpopulation of WBC were observed by Blood Cell Autoanalyzer; the ratios of CD133 ,CD34 , CD3 , CD4 , CD8 , CD56  cells were identified by FCM; and levels of TNFα, IL1β, IL2 were tested by ELISA on 0, 2, 4, 6, 8, 10 day after stem cell mobiliation by GMCSF. RESULTS: The ratios and number of CD133  cells,CD34  cells, WBC and neutrophils weresignificantly increased (P

　　[Keywords]macaqne; stem cell mobilization; immune cell subpopulation; cytokine
- d! y7 r- G' v3 j' y9 h7 p
　　骨髓组织中存在有CD133 、 CD34 细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)等多种具有自我更新和分化潜能的不成熟细胞[1]。这些细胞已在体外诱导分化实验, 人类疾病的动物模型治疗和临床疾病治疗中证实具有参与各种组织损伤修复、造血免疫重建等, 在一些疑难疾病治疗中显示出良好的应用前景[2]。骨髓干细胞(bone marrow stem cells, BMSC)可以被动员进入外周血液循环, 临床可从动员外周血中获取干细胞用于移植治疗恶性血液病、遗传病、血管缺血性疾病、慢性肝病、股骨头坏死等多种疾病治疗。最近还有一些报道, 直接用BMSC动员法治疗心肌梗死、脑中风等显示有治疗效果[3]。相关报道和本研究组的前期实验研究发现, 用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor, GMCSF) 动员BMSC还能有效防治创伤感染和系统性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）等[4, 5]。因此, BMSC动员可能将成为临床治疗的重要手段之一, 有必要建立标准化BMSC动员技术和明确BMSC动员对血液免疫细胞和细胞因子的影响等基本问题。为了解BMSC动员后, 外周血中干细胞亚群、免疫细胞亚群和部分细胞因子的变化, 本研究以灵长动物猕猴为实验对象, 系统观察了相关指标。2 \6 |$ y1 |, {  `- Y6 `4 q1 o
8 S2 y* W5 r! ^; t: y# @. D
　　1材料和方法
3 c& B  d" ~6 ]' G2 y
　　1.1材料健康猕猴10只, GMCSF购自中国医学科学院昆明医学生物学研究所; FACS Calibar流式细胞仪、抗猴CD34、 CD133、 CD3、 CD4、 CD8、 CD56标记单克隆抗体(mAb)购自BD公司; CO2细胞培养箱购自德国HEREARS; ConA购自Sigma公司; RPMI1640培养基购自Life Techenologies; TNFα、 IL1β、 IL2酶联免疫测定试剂盒购自美国Cenzyme公司产品。5 S6 G0 v' i3 P/ L8 N9 i' ~1 E6 S

　　1.2方法# }* G5 a7 Y$ z) H" M) N. h
) Q0 C. K, l6 A8 g
　　1.2.1血细胞分类计数健康猕猴10只(年龄7～10岁, 雄性, 体质量8～10 kg), 连续5 d皮下注射GMCSF, 8 μg/(kg·d), 分别于0、 2、 4、 6、 8、 10 d采集外周抗凝血3 mL用于细胞亚群分析, 采集非抗凝血2 mL用于分离血清和测定采集, 抗凝血0.5 mL, 用血细胞自动分析仪进行白细胞分类计数。! Y' {, R8 V- ?# e* \) M9 I

　　1.2.2淋巴细胞增殖活性检测采用有丝分裂原刺激, MTT检测法。T淋巴细胞增殖活性检测: 用淋巴细胞分层液分离出外周血淋巴细胞, Hanks氏液洗涤2次后, 进行活细胞计数, 用RPMI1640培养液稀释成2109/L。用96孔板培养细胞, 每孔200 μL, 细胞密度为2109/L, ConA(Sigma公司)浓度为20 mg/L, 将细胞置于37℃、 5 mL/L CO2和饱和湿度条件下培养44 h, 去上清50 μL, 加入MTT 10 μL, 细胞继续培养4 h, 加入酸化乙丙醇（0.04 mol/L盐酸乙丙醇） 100 μL, 充分混匀后室温放置10 min, 测定A570值, 按平均刺激指数(MI)计算结果, 公式为: 刺激指数(Index)= ConA刺激孔A1/空白孔A2。( L+ d6 `- v8 g. }4 t& r

　　1.2.3CD34 、 CD133 、 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD16 CD56 细胞分析采用流式细胞术(FCM)分析。取全血100 μL, 用抗猴CD34 、 CD133 、 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD56 mAb经直接荧光标记法标记细胞表面抗原。常温避光15 min后, 用溶解液溶解红细胞10 min, 再用PBS洗2遍后上机检测。

　　1.2.4TNFα、 IL1β、 IL2浓度测定采用酶联免疫测定法, 按试剂盒提供的操作指南进行, 每份样品设置3个复孔, 酶标仪读取A490值。" S9 u6 n, P6 m& _4 {6 }

　　1.2.5统计学处理各亚群细胞数量以升为单位计算细胞总数, 其中WBC、中性粒细胞、淋巴细胞数量按计数结果计算, 其余按细胞比例换算为细胞数/L, 结果使用SAS软件中的ANOVA模型进行分析, 数据用x±s表示。以P0 B2 n2 p, Q9 C2 r  r( O! [

　　2结果( p6 m6 `# v0 q6 R( _, y# ?

　　2.1白细胞总数和淋巴细胞、中性粒细胞比例外周血中的WBC总数和中性细胞比例在动员后6 d内逐渐升高（P0.05）。淋巴细胞比例在动员后1～6 d内下降（P2 `' S  x; U# E+ s0 B

　　图1GMCSF动员后猕猴外周血中白细胞分类计数的动态变化（略）0 Y- o  ~3 D' {# x6 g& z

　　Fig 1Changes of WBC subopulation in macaqne peripheral blood after MSC mobilization* m$ F6 P8 U2 {  J2 I1 H; A9 |
, `5 i% L" R6 t' x7 @5 E1 ~9 n
　　2.2T淋巴细胞增殖活性检测T淋巴细胞增殖活性在动员6 d内均降低（P3 l  U* q! k4 K! [

　　图2MSC动员后猕猴外周血T淋巴细胞增殖活性（略）: Y4 @1 H; {% L1 \5 l4 G

　　Fig 2T cell proliferate activity after MSC mobilization! ^3 u/ {$ `! p/ S8 q* _

　　2.3CD34 、 CD133 细胞比例CD34 和CD133 细胞比例与数量在动员后逐渐升高（P0.05, 图3）。
3 D" [- Q' x% d- u! {
　　图3猕猴MSC动员后外周血CD34 、 CD133 细胞比率变化（略）$ q& `. V7 f0 Y  J- M5 d% Q5 \8 }1 s

　　Fig 3Changes of CD34 , CD133  ratio in macaqne peripheral blood after MSC mobilization
+ V# q9 {9 y; Q3 T; D" E% k  U
　　2.4CD3 、 CD4 、 CD8 和CD56 比例在动员BMSC 2～6 d内, CD3 、 CD4 、 CD8 和CD56 比例均明显下降（P" N- w7 @1 D0 ?* L. Z: {
' N+ [5 W9 l2 a" g% ]3 X
　　图4猕猴MSC动员后外周血免疫亚群细胞比率变化（略）) p: l) W, n5 W% k# [. ^; Y

　　Fig 4Changes of immune subpopulation cell ratio in macaqne peripheral blood after MSC mobilization
* L+ m* ]7 x* o. x5 k
　　2.5TNFα、 IL1β、 IL2浓度外周血TNFα、 IL1β、 IL2浓度在动员后1～6 d均明显升高（P
, k' {$ _# h: u& g$ L
　　图5猕猴MSC动员后外周血中细胞因子含量变化（略）

　/ y! a5 s- A- f; `2 A
* _, n7 G4 I, V3 f! {1 v/ U
　　Fig 5Changes of cytokine concentration in macaqne blood after MSC mobilization5 X  `" _3 B7 b

　　3讨论
/ F2 h# q& N" b+ S) ]- V

　　BMSC可被动员进入血液循环并随血液循环分布全身各组织。BMSC具有归巢特性, 不论是动员还是外周静脉输入的BMSC在体内分布具有选择性, 早期主要分布骨髓、肝、脾等, 而最后主要归巢到骨髓组织[6]。最近的研究发现, 损伤组织可释放一些干细胞趋化因子, 吸引BMSC向损伤区域分布并参与损伤组织的修复[7]。BMSC动员法已被临床用来治疗心机梗死、脑中风、肝损伤和肿瘤放化疗后的免疫重建等。在BMSC动员过程中, 由于骨髓组织中进入血液循环的细胞成份复杂, 动员BMSC在血液循环中滞留的时间长短直接影响疗效, 同时BMSC也有向血液免疫细胞分化的潜能, 对外周中血亚群细胞比例也有较大的影响[8]。为明确BMSC动员对外周血干细胞和免疫亚群细胞比例的影响, 本研究连续5 d注射GMCSF 8 μg/(kg·d), 监测了BMSC动员对外周血亚群细胞数量和比例的动态变化。

# P& ~6 B, H6 l- v
　　结果证明, 在猕猴第1次皮下注射GMCSF后的6 d内, 外周血中的干细胞（CD133 细胞、 CD34 细胞）、白细胞总数、中性粒细胞比例和TNFα、 IL1β、 IL2的浓度均逐渐升至第6天达到高峰, 其中干细胞和细胞因子浓度到第8天时恢复正常, WBC、中性粒细胞比例到第10天时仍高于正常, 表明GMCSF可快速动员BMSC进入血液循环, 但在外周血液循环中滞留的时间相对较短, 停止动员后很快归巢, 而WBC、中性粒细胞比例和TNFα、IL1β、IL2的浓度则在更长时间内高于正常, 其结果与有关报道相似[9]。外周血中的淋巴细胞数量增加, 而比例下降, T淋巴细胞的活性有所下降, 但停止BMSC动员后恢复并升高, 表明干细胞动员同样可使外周血中淋巴细胞数量增加, 只是增加幅度不如干细胞和中性粒细胞等其他白细胞明显, 因而导致比例相对下降。淋巴细胞数量增加可能是由于干细胞动员剂促进成熟淋巴细胞增殖和干细胞或淋巴细胞的前体细胞分化的结果, 因为骨髓组织中的淋巴细胞比例明显低于外周血, 外周血中淋巴细胞数量的增加不是骨髓细胞动员的结果[6]。本研究结果提示, 是利用GMCSF动员BMSC可使外周血中的CD133 细胞和CD34 细胞比例快速短暂升高, 同时对免疫功能具有正调节作用, 可明显提升外周血白细胞、中性粒细胞数量和比例, 促进免疫细胞因子的分泌。BMSC的淋巴细胞比例和活性下降, 并不代表淋巴细胞的功能下调, 因为淋巴细胞的实际数量增加, 而且停止动员后淋巴细胞的比例和活性均恢复正常并有升高趋势, 在动员过程中, IL2浓度明显升高, 具有提高或促进免疫功能的作用。目前有一些报道认为, GMCSF具有防治创伤感染, 降低多器官衰竭和死亡的作用[10], 但本研究发现, 干细胞动员过程中, 与启动SIRS有关的2种细胞因子TNFα、 IL1β浓度均升高, 这2种因子对创伤感染及SIRS发生发展的作用值得进一步研究。
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