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作者：夏冰，*王捷，郭立达，詹纯列，肖育华，杨传红作者单位：（中国人民解放军广州军区广州总医院医学实验科，广东广州510010） : S6 B9 `, R- H
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【摘要】 目的比较体外培养条件下不同种属骨髓间充质干细胞（BMSC）的生物学特性。方法采用贴壁法和离心法，对小鼠、大鼠、家兔和人BMSC进行分离培养。采用光镜和电镜观察细胞形态，MTT法测定生长曲线，免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪分析表面分子Stro-1的表达，并通过试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性、免疫组化检测骨钙素表达以及VonKossa法显示钙盐沉积等手段评价BMSC对成骨诱导液（10nmol/L地塞米松，10mmol/L磷酸甘油和50mg/L抗坏血酸）的反应性。结果贴壁法细胞得率是离心法的10余倍。各种属BMSC光镜下形态不同，电镜下形态相似；生长曲线基本一致。人原代贴壁细胞Stro-1阳性率为（91.4±8.3）%，小鼠为（83.5±6.2）%。在成骨诱导液中，小鼠BMSC向脂肪细胞分化，家兔BMSC死亡，大鼠和人BMSC可被成功诱导为成骨细胞。BMSC在培养中有自发分化现象。结论小鼠、大鼠、家兔和人BMSC可在体外被大量扩增，所得到的细胞是以低（未）分化细胞为主、不同分化程度的细胞混合物。不同种属BMSC在形态学和对同一诱导液的反应性上存在差异。 5 _. E- B% C x- J" f
【关键词】间质干细胞；细胞生理学；细胞培养1 Y' t% K# @2 \3 i) W8 m5 r: i
Comparisonofinvitrocharacteristicsofbonemarrow-derived1 {2 E# H) y6 ] b9 X( |' P
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mesenchymalstemcellofdifferentspecies) }* }: d( e( U6 N
5 Z8 U4 k/ E- H& G$ p7 Q& }5 mXIABing,WANGJie,GUOLida,etal
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. X# F' S) E( r8 DDepartmentofMedicalResearch,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China
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Abstract:ObjectiveTocomparethebiologicalcharacteristicsofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells(BMSCs)ofdifferentspeciesculturedinvitro.MethodsTheBMSCsofmouse,rat,rabbitandhumanwereisolatedbycentrifugalmethodandculturedby"walladhesionculture"procedure.ThemorphologyofBMSCwasobservedunderopticmicroscopeandtransmissionelectronmicroscope.ThecellgrowthcurvewasassayedbyMTT.ExpressionofStro-1wasanalyzedbyimmunofluorescencecytochemistryandflowcytometry.ToevaluatethespecificresponseofBMSCstoosteogenicsupplements(10nmol/Ldexamethasone,10mmol/Lβ-glycerophosphateand50mg/Lascorbicacid),theactivityofalkalinephosphatase(ALP)activitywastestedbyakit,expressionofosteocalcinwasexaminedbyimmunocytochemistry,andhydroxyapatitecrystalswereshowedbyvonKossastaining.ResultsThecellnumberobtainedbyadherentmethodwasmorethantentimesthatbycentrifugalmethod.AdherentBMSCsofthefourspeciesweredifferentinappearanceunderlightmicroscope,butsimilarinultrastructuresunderelectronmicroscope.Thegrowthcurveswerealmostthesame.(91.4±8.3)%ofhumanadherentbonemarrow-derivedcellswereStro-1-positive,and(83.5±6.2)%ofmurineadherentcellsexpressedStro-1antigen.Intheosteogenicsupplements,mouseBMSCsdifferentiatedintoadiposecells,rabbitonesdied,whileratandhumanonesdifferentiatedintoosteoblasts.CulturingBMSCscouldalsospontaneouslydifferentiateinvitro.ConclusionMouse,rat,rabbitandhumanBMSCscanbeeasilyamplifiedinvitro.Althoughtheharvestbycurrentmethodsisamixtureofmesenchymalcellswithvariousmaturity,mostofwhicharelow-orun-differentiatedcells.BMSCsofthosespeciesaredifferentinmorphologyandresponsetothesameinductivesupplement.
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Keywords:mesenchymalstemcells;cellphysiology;cellculture骨髓间充质干细胞（BMSC）在神经系统疾病如帕金森病和损伤修复、甚至恶性胶质瘤的治疗上有潜在的应用价值[1~3]。但BMSC的基本生物学特性尚未完全揭示，成为制约该项细胞治疗技术发展的重要因素。因此本研究分别对小鼠、大鼠、家兔和人的BMSC进行分离和培养，并对其体外生长特性进行初步比较。) M! X, r6 ^, h1 g4 ^
% k, d8 P/ J/ X( G& s! u3 f1材料与方法
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T! ~5 T3 J; E0 u. b) i1.1实验对象昆明种小鼠30只，体质量（16.0±2.0）g；SD大鼠30只，体质量（160±20）g；新西兰大白兔6只，体质量（2.0±0.2）kg。以上动物均雌雄各半。健康志愿者6人，年龄25~32岁，男女各半。
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1.2BMSC分离培养方法小鼠和大鼠在深麻醉下无菌分离出股骨和胫骨，剪开骨两端，用注射器吹出骨髓。人和家兔采用髂骨穿刺法取得骨髓。分别采用离心法[4]和贴壁法[5]，进行各种BMSC原代培养。离心法即采用淋巴分离液离心抗凝的骨髓取得单个核细胞，然后置于培养瓶中，用含10%胎牛血清（杭州四季青公司）、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的低糖DMEM（Gibco公司）培养基常规培养。贴壁法则不用离心，直接将骨髓吹打成单细胞悬液进行培养，3d、6d、9d3次半量换液后，每3d全量换液1次。
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1.3形态学观察用倒置光学显微镜（Zeiss公司，Axiovert40型）及透射电子显微镜（日本日立公司，H-600型）观察培养细胞的形态。
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1.4生长曲线测定采用MTT法。以每孔5103个细胞接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，每隔1d对1行（12孔）细胞进行MTT呈色反应检测，连续检测16d。呈色反应前每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，孵育4h，然后吸弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上测定各孔OD490。以时间为横轴，OD490为纵轴绘制细胞生长曲线。1 ~, W! i+ Z* z
\2 P, W ^4 \1.5表面分子Stro-1的检测采用免疫荧光细胞化学法和流式细胞分析。免疫荧光细胞化学染色步骤为10%BSA封闭非特异结合位点，加一抗（小鼠抗人Stro-1单克隆抗体，美国RD公司，工作浓度10μg/ml），37℃湿盒中孵育45min，PBS漂洗，加荧光素标记的二抗（羊抗小鼠IgM-FITC，英国KPL公司，工作浓度1∶200），PBS漂洗，蒸馏水冲洗，未干时加缓冲甘油封固，荧光显微镜观察。同时设立荧光抗体阴性对照及自发荧光对照。流式细胞分析采用免疫荧光间接法染色，阴性对照采用纯化的小鼠IgM同型（美国Biolegend公司，1∶200）。/ y5 {, L% ^" S% E
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1.6对成骨诱导液反应性的检测联合采用抗坏血酸50μg/ml、地塞米松110－8mol/L和磷酸甘油10mmol/L对BMSC进行成骨细胞方向的诱导，通过试剂盒（南京建成生物技术公司）检测碱性磷酸酶（ALP）的活性、免疫组化检测骨钙素表达以及VonKossa法显示钙盐沉积等方法评价诱导效果。免疫组织化学染色采用链抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法。操作步骤参照SP试剂盒（福州迈新公司）说明。一抗为山羊抗大鼠骨钙素多抗（美国DSL公司，工作浓度1∶1000），二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精对比染色。以已知阳性片为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作空白对照。VonKossa法将细胞爬片浸于2%AgNO3溶液中，在60W钨灯下照射1h，蒸馏水洗，浸于5%硫代硫酸钠中5min，蒸馏水洗，0.33%中性红复染5min，自来水冲洗，梯度酒精脱水，透明，封片。
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2结果$ }, O+ ?. m7 t0 i2 u/ f" O
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2.1贴壁法和离心法原代培养的比较4种BMSC细胞，贴壁法的得率均高于离心法10倍以上。可能因离心会损失部分BMSC，而且贴壁法保留骨髓中的其他细胞，如造血干细胞和已分化的间质细胞，对BMSC的存活和增殖有某种促进作用。
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2.2不同种属BMSC体外培养形态的比较贴壁生长时，不同种属BMSC在形态上差异比较明显。小鼠与人BMSC细胞比较细长，密度大时呈菊花状、漩涡状或平行排列；大鼠和家兔细胞比较粗短，密度大时仍呈不规则多边形，多呈阶梯状平行排列（图1）。在成熟或老化阶段，小鼠细胞变扁平，呈不规则多角形，紧密排列的一群细胞可呈鹅卵石样，最后破碎，成点状沉积在瓶底；而大鼠、家兔和人的细胞老化后体积明显增大数倍，变薄，仍呈多边形，胞浆中出现空泡，或有泥沙状物，最后呈棉絮状漂起、自瓶壁脱落。各种属BMSC也有一些共性，如均可多层重叠生长，无明显的接触抑制；培养的原代细胞在形态上均可分为两种类型，一类细胞呈克隆生长，增殖迅速；另一类细胞散在分布，继续培养数目不会增加，而是逐渐死亡。电镜下，原代细胞有微绒毛突起，有1个分叶核和1个核仁，形态上也分为两种细胞，一种具有丰富的细胞器，如线粒体、核糖体、高尔基体、溶酶体等，以常染色质为主（图2）；另一种细胞器很少，异染色质较多且边聚明显（图3）。1 _! c* q, h: L7 I/ D; v
1 z5 H: v& m0 a2.3BMSC生长曲线的比较4种BMSC的生长曲线基本相同。传代后经过1~2d滞留期，第3天进入对数生长期，经过10d左右后达到平台期，此时细胞数目不再增加，维持5d左右后开始逐渐减少。如果在细胞长满80%~90%时及时传代，可恢复增殖能力。BMSC细胞密度与增殖能力成反比，如果原代培养或传代时接种密度太小，则细胞处于休眠状态，不进行增殖。此外，传代细胞虽仍可增殖，但扩增能力有所降低。* y: I4 R0 {8 _2 F
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2.4人和小鼠BMSC细胞Stro-1分子的表达因只有市售的抗人Stro-1抗体，小鼠对其有交叉反应性，所以我们仅对这两种BMSCStro-1的表达进行检测。结果发现在培养的人BMSC原代细胞中，Stro-1阳性率为（91.4±8.3）%（图4），小鼠BMSCStro-1的阳性率为（83.5±6.2）%.- v8 D' R5 b. a8 ~7 f. J, t5 r3 Y
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2.5不同种属BMSC对成骨诱导液的反应性比较在成骨诱导液中，小鼠BMSC逐渐向脂肪细胞分化。家兔BMSC不能耐受诱导，细胞质出现空泡样变，死亡细胞明显增多。而大鼠和人BMSC可被成功诱导，细胞在诱导前ALP活性低，多数不表达骨钙素，无钙盐沉积；诱导后ALP活性增加，细胞质骨钙素呈阳性，钙盐沉积明显。3 d" W; E5 J3 i
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3讨论- U3 K1 l) z* _" l! {6 T' b4 c
1 N: t1 j% C8 |( A2 P/ t* h本实验发现BMSC不仅具有多系分化潜能及高增殖性等特点，还具有如下两个特点：①细胞的分化程度具有不同步性。培养所得的骨髓贴壁细胞实质上是不同分化阶段间充质细胞的混合体，可粗略分为低（未）分化群和高分化群。这两群细胞首先可从形态上进行鉴别。光镜下，低（未）分化群呈克隆生长，增殖迅速；高分化群细胞散在分布，处于不增殖的静止状态，不仅数目不增加，反而在继续培养中会逐渐死亡。电镜下，一类细胞的细胞器丰富，以常染色质为主，提示处于增殖活跃期，为低（未）分化群；另一类细胞的细胞器少，异染色质较多，处于静止期，应属于高分化群。其次，通过检测表面标志分子的表达也可鉴定这两群细胞。Stro-1是一种较特异的BMSC标志抗原，Stro-1阳性细胞是低（未）分化群细胞，阴性者为高分化群。本实验中，人骨髓原代贴壁细胞中有近10%不表达Stro-1，为较成熟的间充质细胞，大约90%为低（未）分化的间充质干细胞，这与Colter等[6]的研究结果一致。根据Stro-1的表达特点，进一步采用流式细胞仪或免疫磁珠分选技术，可将两群细胞分离，去除高分化者，即可得到较纯的真正意义上的“干细胞”。②BMSC在体外培养过程中存在自发分化现象。在原代培养的BMSC克隆中，少量细胞表达成骨细胞标志分子如骨钙素和ALP，提示干细胞在体外人工培养环境中可发生自发分化。自发分化，不仅造成低（未）分化细胞比率在长期体外培养和多次传代中逐渐降低，而且由于分化的方向是未经人工调控的、难以预测的，有可能得到不希望和（或）不需要的细胞类型，从而大大影响其临床应用。因此，如何在体外既大量扩增BMSC又维持其去分化状态，成为目前急需解决的技术难题之一。
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本研究还发现，BMSC在形态和反应性上具有种属特异性，即：①贴壁生长的方式不同。虽然经消化变成悬浮细胞后用电镜观察到的形态比较相近，但是，在体外贴壁生长时，不同种属BMSC的细胞形态明显不同。②对同样诱导剂的反应不同。不同哺乳动物种属间的BMSC虽然增殖能力相近，但是在对定向分化诱导物的反应上存在较大差别。因此，动物实验的结果不可盲目类推到人，而应本着严谨的科学态度，新的干细胞疗法在取得充分的动物实验依据后，还必须经过足够的人体试验，取得可靠结果后方可考虑在临床上广泛应用。( d+ |3 L# i! o, ?% W
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发表于 2009-3-3 12:02
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