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发表于 2009-3-3 12:17 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

作者：王  宾  沈来根  朱越锋  李鲁滨  郭治宇  刘振杰作者单位：322100 浙江省东阳市人民医院 310016 浙江大学附属邵逸夫医院　324000 浙江省金华市中心医院　200000 复旦大学附属中山医院在读博士
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      【摘要】  目的  培养和鉴定兔骨髓间充质干细胞,基因转染后观察hVEGF165在其中的表达。方法  体外培养兔骨髓间充质干细胞,以流式细胞仪检测其表面抗原(CD29、CD44、CD45、HLA-DR)的表达。通过腺病毒载体转染hVEGF165后,采用RT-PCR、Western blot法检测hVEGF165在细胞中的表达。结果  通过流式细胞仪检测表明培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞, RT-PCR法、Western blot法检测结果均表明hVEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞后能在其中表达。结论  成功培养兔体外骨髓间充质干细胞, 基因转染后细胞能有效表达hVEGF165。 3 z/ B/ P$ q0 C) ^- j; \9 j
      【关键词】目的  培养和鉴定兔骨髓间充质干细胞,基因转染后观察hVEGF165在其中的表达。方法  体外培养兔骨髓间充质干细胞,以流式细胞仪检测其表面抗原(CD29、CD44、CD45、HLA-DR)的表达。通过腺病毒载体转染hVEGF165后,采用RT-PCR、Western blot法检测hVEGF165在细胞中的表达。结果  通过流式细胞仪检测表明培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞, RT-PCR法、Western blot法检测结果均表明hVEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞后能在其中表达。结论  成功培养兔体外骨髓间充质干细胞, 基因转染后细胞能有效表达hVEGF165。
   　　【Abstract】ObjectiveTo cultivate and accredit rabbit mesenchymal stem cells ,and to detect the expression of hVEGF165 after gene transfection. MethodsRabbit mesenchymal stem cells was accredited expression of antigen CD29、CD44、CD45、HLA-DR after cultivated in vitro. The constructed plasmids containing right sequence of hVEGF165 were transfected into rabbit mesenchymal stem cells by adenovirus.The expression of hVEGF165 was tested by RT-PCR and western-blot. ResultsThe expression of antigen of cells indicated the cells were rabbit mesenchymal stem cells. The results of RT-PCR and western-blot showed that the transfected cells could express hVEGF165. ConclusionThe rabbit mesenchymal stem cells can successfully express hVEGF165 after gene transfection., T9 c/ V/ f3 E. s# $ H

　　【Key words】mesenchymal stem cellsvascular endothelial growth factor ( VEGF)gene transfection, expression$ E* v0 g* {( z* P4 ]; E5 V
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　　骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有多向分化潜能的细胞，可分化成多种间质细胞，如成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，也可分化成神经系统的神经元细胞、神经胶质细胞和脉管系统的血管内皮细胞,成为近年来基因组织工程研究的热点。血管内皮生长因子(VEGF) 是一种高特异性的内皮细胞有丝分裂原, 能促进血管内皮细胞分裂、增殖, 形成新血管［１］。本研究通过体外培养兔骨髓间充质干细胞,用基因转染技术将VEGF基因导入细胞, 观察其在细胞中的表达。在此基础上可将骨髓间充质干细胞与VEGF结合植入缺血区, 通过MSCs与VEGF的双重作用, 来促进局部血管增生,治疗慢性缺血性疾病。
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　　1材料与方法

　　1.1材料(1)细胞和腺病毒:兔骨髓间充质干细胞自行培养和鉴定,含hVEGF165的非扩增型腺病毒和含GFP的非扩增型腺病毒购自上海生物基因科技发展有限公司。(2)主要试剂：DMEM培养液和淋巴细胞分离液购于上海生物有限公司；胰酶购自杭州公司; TRIZOL购自Sigma公司;mRNA逆转录酶（M-MLV）购于Promega公司；蛋白裂解液购自Satancruz公司;羊抗人hVEGF165单克隆抗体购于Sigma公司;兔抗山羊二抗购于北京公司;ECL化学发光试剂购自联科生物公司;R－Phycoerythrin（R-PE）标记的鼠抗人HLA-DR的单克隆抗体购于BDBioscience公司,可跟兔交叉反应;鼠抗兔CD44、CD45单克隆抗体购于Serotec公司，鼠抗人CD29单克隆抗体购于Chemicon公司,可跟兔CD29交叉反应。(3)RT-PCR引物设计和合成根据GeneBank中登录的目的基因序列,以引物设计软件Primer Express2.0辅助自行设计引物, 上游引物5′-TCT GCT GTC TTG GGT GCA TTG-3′ 下游引物5′-ATG GCA GTA GCT GCG CTG ATA G-3′,目的片断为150bp,引物由上海公司合成。
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　　1.2方法(1)MSCs分离与培养：无菌操作从兔胫骨抽取骨髓3ml，与等体积DMEM培养液（含16％胎牛血清）混合后，铺于6ml的淋巴细胞分离液之上，离心（2500r/min）25min，取中层单个核细胞，置于含DMEM液的细胞培养瓶中，在温度37℃，含5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，24h后首次换液，以后每5d换液一次。经不断增殖培养至细胞数达107用于鉴定或转染。(2)MSCs的鉴定：取生长状态良好的细胞，自第3代至第6代，采用流式细胞仪对MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR的表达进行检测。抗体分别是R-PE标记的鼠抗人B细胞HLA-DR的单克隆抗体、鼠抗兔T细胞CD44、CD45单克隆抗体、鼠抗人CD29单克隆抗体。后三种一抗均与Rhodamine标记的山羊抗鼠二抗结合后流式细胞仪检测。(3)VEGF转染MSCs：MSCs培养至107后，向培养瓶中加入含hVEGF165的非扩增型腺病毒，共同培养48h后以胰酶消化制成单细胞悬液供移植用。同时取部分细胞在相同条件下加入含GFP的非扩增型腺病毒，48h后在荧光显微镜下测定其转染率。(4)总RNA 的提取及RT-PCR 扩增: 转染后得到的表达hVEGF165的MSCs,同时设hVEGF165质粒为阳性对照,转GFP的MSCs为阴性对照,用TRIZOL常规提取总RNA ,经逆转录合成cDNA 进行PCR 反应。采用高保真Taq NA聚合酶进行PCR扩增,扩增条件为95℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,扩增30个循环, 最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离,鉴定目的片段的表达。(5)Western-blot鉴定目的蛋白的表达:转染后得到的表达hVEGF165的MSCs,同时设转GFP的MSCs为对照。常规方法提取细胞全蛋白,取50μg蛋白,与2SampleBuffer1∶1混匀后煮沸10min,10%SDS2聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,然后电转移至PVDF膜(Millipore,孔径0.45μm,USA),用含5%脱脂奶粉的TBS封闭2 h,加羊抗人VEGF抗体(1∶500)4℃反应过夜,然后与偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG(1∶5000) 室温反应2h,每步反应结束均用含0.05% Tween-20的TBS洗涤3次,每次10min,最后用ECL液显色,X片曝光。; I# t! {5 E. f! Q

　　2结果  x  o( ?( _2 g) v  S" ^" Z" d
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　　2.1原代MSCs 24h后即出现贴壁细胞，以后细胞呈克隆样生长。经传代后细胞生长加快，呈现梭形形态（图1）。
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　　2.2MSCs的鉴定各抗原表达如下(表1,图2)

　　表1MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR表达　略/ D$ T! t8 L0 N
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　　2.3VEGF转染MSCs转染hVEGF165及GFP后未见细胞死亡，48h后在荧光显微镜下可见强荧光表达，转染率近100%（图3）。1 f! r/ p1 t" k# ^% p

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　　2.4RT-PCR检测结果hVEGF165质粒和转染hVEGF165的MSCs的RT-PCR扩增产物可见目的基因条带(图4),而转染GFP的MSCs扩增未见条带。
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　　2.5Western blot结果转染hVEGF165的MSCs提取的蛋白,分别在23kD处有一条明显阳性杂交带, 而转染GFP的MSCs提取蛋白未见阳性条带(图5),这表明转染目的基因的细胞表达VEGF蛋白。! I9 g6 I% Q! q( f  e. M

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　　图348h后荧光显微镜观测转染携带GFP的非扩增型腺病毒的干细胞；略
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　　图4RT-PCR产物电泳图(略)
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　　图5转染后细胞提取蛋白Western blot结果(略)

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　　3讨论8 c& t8 G( I$ G' a4 ~! R
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　　干细胞移植，在基础领域和临床研究中均取得了一系列成果，其中多以造血干细胞为研究对象［２］。而MSCs在体外可以通过贴壁培养加以分离，分裂增殖能力强。由于存在骨髓中，采集方便，对机体损伤小。可以向多种结缔组织细胞分化，并易于被外源基因转染且稳定表达，因此被认为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞。+ i/ p3 ?1 _. ~# {) e3 f  M
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　　MSCs具有特征性的表面标志。特点是不表达CD34（造血干细胞及内皮细胞呈阳性）、CD45（白细胞呈阳性）、HLA-DR（抗原呈递细胞及成纤维细胞呈阳性）；而表达CD29、CD44、CD105、CD166等MSCs特异性表面抗原标记［３］。流式细胞仪检测结果显示所培养细胞的表面抗原CD29、CD44有阳性表达，而CD45、 HLA-DR是阴性表达。说明所培养的细胞不是骨髓中的另1大类细胞-造血干细胞，而是骨髓的间充质细胞。$ V: w3 h6 [8 K4 ?* R$ e  g- r
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　　VEGF［４］是一种特异性的与血管生长有关的生长因子，在缺血等病理条件下VEGF及其受体表达明显上调，参与血管再生机制及侧支循环的形成。其主要生物学效应是与内皮细胞表面的特异性受体结合, 促进血管内皮细胞发生分裂和增殖［１］,尤其VEGF165的促血管作用最明显［５］。目前研究多采用VEGF基因或VEGF构建的质粒/缺陷腺病毒直接注射的方法，但存在表达时间短，局部水肿［６］的问题。而采用VEGF转染MSCs，再进行细胞移植，有可能使MSCs持续表达VEGF，增加VEGF的表达。
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　　今后拟将MSCs与VEGF相结合,在局部组织缺血时通过自分泌和旁分泌途径, 提供足量的促进血管生长的生长因子, 以促进其自身及内皮细胞增殖分化及血管的形成, 为基因生物工程治疗缺血性疾病提供实验基础。0 W% I- J( F  ~
      【参考文献】' h- g6 z3 c  _
　　1 Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med,1999,77 (7):527～543.
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　　2 虞荣喜. 造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤的进展. 浙江临床医学，2004，6（9）：737.

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  |% N. c. k) v+ _1 G! a
　　3 Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et a1．Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs) and stromal cells．J Cel Physiol，1998，176：57～66．

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　　4 Brogi E,Schaheman G,Wu TG,et al.Hypoxin-induced paracrine regulation by vescular endothelial growth factor expression.J Clin Invest,1996，97:469～476.

　　5 DENG Zhi-hong, HUANG Wei-guo,JIN Yan.Expression of VEGF and Flk-1 in normal and chronic inflamed membrane mucosa laryngis.J Cell Mol Immunol,1998,14(1):54～56.(in Chinese)! ]! M9 {! U  J# B( L9 L1 G$ p
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　　6 Baumgartner I,Rauh G,Pieczek A,et al.Lower-extreming edema associated with gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor.Ann Intern Med,2000,132(11):880.　

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