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AdEasy系统工作原理6 S& R$ `5 b7 q( _; x9 b
AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。所以Adeasy系统同样也可以用于复制型腺病毒的包装。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，线性化的目的是切掉重组子的原核表达元件，同时其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats）也被暴露出来。转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。- A! Q1 h$ d" \) T' `6 ?
大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。
' Y8 s1 `& ^( h# ]- R a. TAdEasy系统包装腺病毒要求简单，理论上只要有BJ5183菌株和pAdEasy合穿梭质粒pShuttle或pShuttle-CMV即可。最初的AdEasy系统在BJ5183菌株重组时是将两个质粒共转入菌株中，属于一步法重组，改进后的方法是先将pAdEasy转入感受态的BJ5183中，再将pAdEasy-BJ5183做成感受态，之后再将PmeI线性化的穿梭质粒pShuttle或pShuttle-CMV通过普通的转化转入pAdEasy-BJ5183感受态中。这种方法分两步转化，所以叫做两步法重组。两步法重组实验条件要求较低，不需要高效率的感受态，而且重组效率也比一步法高，比较常用。但是将pAdEasy放入BJ5183这种支持重组的菌株中，可能会不太稳定，最好同时保存pAdeasy的质粒。
4 v0 C0 o+ X' B* U/ e/ }AdEasy系统包装腺病毒流程
& j& h4 M6 J3 N5 q2 |AdEasy系统包装腺病毒流程可以分为三个部分：①将目的片段连入pShuttle或pShuttle-CMV，做好穿梭载体的构建。AdEasy系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。②将构建好的穿梭载体用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中。在转化之前必须确证所列的PmeI线性化位点不存在于插入的基因中。有时候EcoRI也可用来进行线性化。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。③筛选的重组子用PacI线性化后，转染293细胞。+ H/ B+ ^9 [0 V" ] k# {/ {
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3 h9 K& Y3 d0 Y: @8 _ Y. J具体操作细节注意：5 `. z: O5 h/ @
一、穿梭载体构建; g/ u ]9 I/ X$ |: l5 U6 L. k7 X3 v
① 一定要保证连入的片段内不含有线性化时用到的酶切位点。
|* r3 e Q. s [ S$ e- X② 在构建复制型腺病毒时，要注意保持腺病毒基因组的完整性和连续性，不能连入多余的片段，也不能缺少某些片段，因为同源臂同时也是腺病毒基因组的成分。
' Y: T1 H8 Z6 _. v; y1 B5 L @③ 不要超过穿梭质粒的克隆能力。在pShuttle和pShuttle-CMV中分别插入大于7.5kb和6.6kb的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生DNA重排，生长速度也将减慢。
9 B/ \. [2 o- A0 x. P2 K& y④如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如CMV启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。 }, V6 w1 p) T1 {3 n
二、穿梭载体的细菌内重组; t2 j' V6 {% r$ x* }, y5 `3 `4 H
首先要知道的一点是线性化的穿梭质粒在BJ5183菌株中和pAdEasy重组的效率是很高的，所以只要线性化的质量好，筛选板上是一定有阳性的重组子的。
( R2 J9 Z( G2 p5 L① PmeI或EcoRI线性化时，消化应尽可能彻底，以减少背景信号，线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入65℃ 20分钟进行灭活。2 K: n1 c+ w, z" i3 A$ j% _
② 要有对照：将线性化的片段分别转化BJ5183和DH5α。保证DH5α板上没有或有很少克隆。) s r3 J5 T- l, K" P
③ 经验：BJ5183生长速度快于DH5α，涂板时，阳性板最好有高浓度的kanamycin浓度（一般工作浓度为10μg/ml,阳性板可用到50μg/ml）。! G, {* X: n8 A2 Y r$ g! U+ b, C5 y
挑阳性板挑克隆时间一般是16小时以后，板上的克隆会出现大小不均（即使阴性板上没有克隆），而且大小克隆相差很大的现象。挑选比中等大小克隆小些的克隆，摇菌鉴定。
+ \' m I2 t; h3 ^④ 阳性克隆的鉴定：一般是选用PacI酶切。PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同（似乎更倾向于通过原核ORI与另一个同源臂重组，PacI酶切鉴定时出现4.5kb片段）。但是PacI价格比较贵，用于鉴定比较浪费。发现用MluI用于重组子的鉴定，结果同样可靠（酶切图谱为1k，1.8k，4k，5.8k，20k左右）。如果插入片段带有MluI，鉴定结果更加可靠。& A* t( `) Z7 i& V' T
⑤ 转化酶切鉴定得到的候选重组子到DH5α，这一步比较关键，因为BJ5183中的质粒是不稳定的，一定不要用鉴定剩余的菌液接种摇菌或保菌。转化后的DH5α生长速度很慢而且有的重组质粒会转化失败，原因可能是BJ5183菌株中提取的质粒可能带有DH5α菌株不兼容的修饰，所以这一步有可能是最费时间的一个过程。
% t! I( V" d2 U2 D( h/ [7 f- D8 n⑥ 挑单克隆鉴定第一次转化DH5α生长的克隆，这步鉴定的阳性克隆基本是已经是真正的阳性重组克隆。取鉴定时提取的阳性克隆质粒再次转化，可用于后续试验。" U. X. [* f5 m! x: o
三、重组子转染293细胞5 c- M* _) Y$ f, Q/ F w2 ~4 Q6 j6 u
PacI线性化重组子质粒，切掉原核表达元件，乙醇 |
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发表于 2010-7-22 01:39
发表于 2010-8-3 08:04
