DNA甲基化常见问题

恒宇

DNA甲基化常见问题100问$ c( x! t6 m8 Z" |# Y
1. DNA甲基化是什么？
9 ?3 ?5 c" {) Y+ J2 h# h& y答：甲基化（DNA methylation） DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
/ r$ k! Z: Y, j　　在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。) ^: [$ c, Y8 r0 d4 T: B
　　DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）
2 d& Y7 o/ k5 x' T- B
. f2 K3 J) I/ y- c  \  Z- Y2. DNA甲基化发生在什么位置？
" J! W3 i6 S+ S2 B/ S/ E答：含有很多CpG 结构, 2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。基因组中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛, 位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化, 使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点, 以及DNA 酶的敏感位点, 使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 失去转录活性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能导致基因置换突变, 发生碱基错配: T2G, 如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症, 而且, 生物体甲基化的方式是稳定的, 可遗传的。
4 L5 x+ Y( S- o5 f  {: s& h! E# g) [1 n% F. }9 L; S! z4 L9 Y
3. DNA甲基转移酶有哪些？4 x6 Z. g2 Q" ]' e" d
答：DNA 甲基转移酶有两种: 1) DNM T1, 持续性DNA 甲基转移酶—— 作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链, 使其完全甲基化, 可参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化,DNM T1 可能直接与HDAC (组蛋白去乙酰基转移酶) 联合作用阻断转录; 2)DNM T3a、DNM T3b从头甲基转移酶, 它们可甲基化CpG, 使其半甲基化, 继而全甲基化。从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控, 其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。
. f+ N: @2 G% D9 \2 E0 N
" f. E, V' p+ [6 C' u4 Z# d# U4. DNA去甲基化的方式？
2 q) a! B7 O7 K8 j( q/ t; Z1 ^3 P$ [4 a答：有两种方式: 1) 被动途径: 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA , 使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化, 从而阻断DNM T1 的作用; 2) 主动途径: 是由去甲基酶的作用, 将甲基集团移去的过程。在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中, 甲基化CpG 粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets, 使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录, 但是, 甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1、CTF、YY1) , 使它们失活, 从而阻断转录。人们已发现5 种带有恒定的甲基化DNA 结合域(MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3 参与甲基化有关的转录阻遏;MBD1 有糖基转移酶活性, 可将T 从错配碱基对TöG 中移去,MBD4 基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关。在MBD2 缺陷的小鼠细胞中, 不含M ECP1 复合物, 不能有效阻止甲基化基因的表达。这表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的选择, 以及DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组相互联系中的有重要作用。1 Y: L4 w1 j6 p
! F: f- ^! u$ ]- k( v
5. DNA甲基化的作用？
# t( ?* [$ Z4 Q5 C/ s2 ]) @4 R答： , m) k. Y! J2 F! u9 m# ?
1) 基因C →T 突变
. l. ^7 z0 T" p8 Z% D! o/ A      DNA 甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。DMT可以加快C(胞嘧啶) 和5mC 脱氨,封闭U(尿嘧啶) 的修复,并且使U →T 改变,故DMT 促使CpG序列的C →T突变 。
7 G: ]! ]( l. C% c& B      抑癌基因p53就是一个典型的例证。50% 实体瘤病人出现p53基因突变。突变中24% 是CpG 甲基化后脱氨引起的C→T 突变。
# R: n$ R# o4 K7 @6 r2) 影响基因错配修复　$ F, h: K% L) }& s4 W" K1 y
      DNA 错配修复系统(DNAmismatch repair system，MMR) 是指存在人类细胞中的一种修复DNA 碱基错配的安全保障体系，它是由一系列特异修复DNA碱基错配的酶分子组成。Ahujia 等研究发现MMR 缺陷时,CpG岛的甲基化增强,并认为MMR 与DNA 甲基化有关。在基因错配修复过程中甲基化具有导向识别作用,而在错配修复基因表达缺陷的原因中基因突变和基因启动子区的高甲基化是其主要原因 。
" _+ w$ b8 B) O+ e& Y/ p- o7 I9 u% R5 S3) 基因沉默
; T6 N7 a8 E0 w, A* k" C$ S      目前认为,甲基化影响基因表达的机制有下列几种： ①直接作用。基因的甲基化改变了基因的构型，影响DNA特异顺序与转录因子的结合,使基因不能转录； ②间接作用。基因5′端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白(methyl CG-binding p rotein)结合，阻止了转录因子与基因形成转录复合物； ③DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质环境。DNA去甲基化常与DNase I高敏感区同时出现,后者为基因活化的标志。% F7 K$ n+ D+ w( M' r* B1 K

( Z: s$ _; I' w1 i6. DNA甲基化的检测方法？. N+ {  {; e) N: b5 E2 q" B& |7 Z
方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。
% @' T2 s  ~) G9 [. n1)  基因组整体水平甲基化分析1 P7 ]. i2 E3 C: T1 `
      a) 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
$ H) B- f6 a0 H& Q      b) SssI 甲基转移酶法
, ~# O0 X  x' v) V3 g5 ^" x' a      c) 免疫化学法1 r9 e. c3 F2 m  [5 K) H+ F
      d) 氯乙醛法
) q/ c2 [" g9 ~$ C. L+ B2)  特异性位点的DNA甲基化的检测
# m: q" v6 N6 Q: k  v. M      a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法1 Z4 I. s3 `; s3 c. Q
      b) 直接测序法
' L* m. ^) `# {- o6 @      c) 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）' P& ?5 A$ o4 I8 B& u8 L/ L
      d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE); e* [+ I0 L7 D, D* ?
      e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）* B0 k& t9 I5 g
      f) 甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）: S# y( j* o& s
      g) 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE）
) J2 P) m, a0 }& j8 n      h) 甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）& }4 ^3 ~; t! A0 E2 R
      i)  荧光法（Methylight）
: K8 M9 o0 D+ u% p$ f* Z3 c' {      j) DNA微阵列法4 n/ E/ f6 `' Y7 B. Y. {
      k) 甲基化敏感性斑点分析（methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA）6 C$ c% }6 v9 o) a
      l)  甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)  
9 U2 Q5 |: u' I, ]( u' R3)  甲基化新位点的寻找
1 W, e* g, q! P- k    a) 限制性标记基因组扫描（restriction landmark genomic scanning，RLGS）- T) H4 g. i( i  v/ n- Z
    b) MBD（Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合区）柱层析法
( u3 x1 {- @7 |$ t    c)  联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD（Combination of methylated-DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes，COMPARE-MS）/ l1 R5 E. a; a4 C8 z
DNA甲基化的形成和意义是什么？  F8 q2 G' }6 Q6 x. I$ B: D1 a
在真核生物ＤＮＡ中，5-甲基胞嘧啶(ｍＣ)是唯一天然存在的化学性修饰碱基，哺乳动物中ｍＣ约占Ｃ总量的2～7%。ＣＧ二核苷酸是最重要的甲基化位点，在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化区，低甲基化区和非甲基化区。甲基化通过图式和数量的改变，在生物遗传信息的调节过程中起重要作用。一般来说，DNA甲基化与基因表达呈负相关。不仅启动子区高甲基化与基因表达呈负相关，基因内部的甲基化与基因表达也存在着弱的负相关，而启动子区低甲基化与转录活性正相关。在体外，已甲基化的序列转入细胞后可抑制表达；相反，许多内源基因在经甲基化抑制剂——5-叠氮胞嘧啶处理后被激活。  Q5 [* ]' ?+ [8 Y+ a" f

8 N1 o! E+ B5 B4 H$ \哺乳动物发育、分化是一个复杂的过程，涉及多种因素，其中DNA甲基化是正常发育、分化所必需的，并可能是真核细胞中发生基因失活的重要因子。在基因印记、X染色体失活、某些疾病的发生中发挥重要作用。其作用的直接的机制是CpG岛的甲基化干扰了一些转录因子(TF)与基因调控区的结合，这可能是因为甲基从DNA分子的大沟中突出，阻止了转录因子与基因相互作用。另外，DNA甲基化还可能直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表达。间接的机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，两种情况都间接阻碍TF与DNA结合而抑制转录。近20年来随着研究方法的改进，已清楚地揭示了甲基化的两种功能，即在发育和分化中调控基因的表达；中和潜在的危险的DNA序列，如转座子和外源病毒等。