巢式PCR没有条带 求达人帮助！

philexchang

我扩增的是的HIV患者基因组DNA中病毒的env包膜蛋白，用巢式PCR,但是扩了好久一直没有条带，退火 48°--52°都做过，也做了TOUCHDOWN PCR，引物也换过，增大模板浓度就像从右边数第二条弥散状条带，减少模板浓度就像从右边数第三条只有引物二具体，求大家帮忙啊~~~~- Y% @7 t" c6 @7 \1 C1 @# u) f

2010-7-27 09:17 上传

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gyuxutong

两对引物是一起放进去的吗？如果是，建议先放外引物做二十个循环，然后再加入内引物，我以前这样做是有效果的！另外，也不排除引物3‘端的不匹配问题！

philexchang

回复 2# gyuxutong
  q  Q( ^0 ], p) M
8 Z" W- v( @1 x; O$ Y4 B我不是一起放的 ，先P外套，然后重新配体系，做内套的PCR,以第一轮产物为第二轮的模板，我的第一轮是4kb,第二轮长1.1kb,我用的酶是EX TAq,谢谢啊~~~

hdc2001

第一轮的片段有4kb啊？建议你用用LA Taq，从图上看，貌似引物特异性不是很好。如果你觉得引物没说明问题的话，试着加大Mg2+浓度。

philexchang

回复 4# hdc2001
# g. z! |0 R; q+ i3 n, ~2 D' }5 v% L! [  V$ Q

  V& v- @* v; g( S3 a% ~3 m7 T' n    好的，多谢提醒！

philexchang

回复 4# hdc2001
$ W# Y2 U) z4 E. O2 r8 s
7 {6 `% h+ a- B4 s5 v我用的是EX Taq，这个酶不是可以扩到4kb吗？恩谢谢前辈  我再试试

肖锋

模板的纯度考虑一下。