做细胞免疫荧光的时候为什么细胞在透膜之前就都掉了

taoqilh

我在做小肠上皮细胞的免疫荧光的时候，用4%多聚甲醛固定30分钟后透膜，可是再透膜之前细胞就全掉了，请问问题是出在哪呢，我在操作过程中很小心，液体都是沿着壁打进去的，为什么细胞还掉呢？

sfk06

你细胞掉可能有以下原因造成的：1 和该细胞的特点有关，即你贴壁所需时间是还是短。这个你可以通过细胞培养知道。我没有养过这个 2你做实验时细胞状态不好，这个要考你养细胞的硬功夫了 呵呵 3做实验时细胞掉是正常的，不过要有足够细胞 进行试验，不然就要想办法了  Q5 i7 a, L( E( L( k1 S* Q9 ]
我认为你的原因有以上的一个或综合原因。建议：在做一次试试

exin11

不同细胞类型，贴壁状态不同，有松有紧，像猪成纤维细胞贴的紧，小鼠的Gsc挺松。
) |9 |( i4 ?' n) f) n- C8 r7 i不知你的盘是什么公司的，有的盘壁附性缺失不好！

grace

回复 3# exin11 ! O9 ^  M# @! e
; S" g1 P, C' m6 W/ u( H. q# i) y

0 H1 Q  f3 K4 z; F/ l% i可用鼠尾胶原包被coverslip;+ x: ^  k" M( u' f% r' ~, B* ]
另外确定你所加药物是否会影响细胞贴附；. C9 n" C% t0 s  [7 X
若做confocal,可用costar的petridish。

exin11

回复 4# grace
& r! N, N0 A% k9 A: d2 t; e8 a: L  J. G+ L/ r  G) U  T  j# _9 m
9 E9 D. v$ d) R8 S" _# q
    你咋回复我了！？呵呵

sfk06

对了，可能还有一个原因是因为 你的片子可能不是太干净。你可以用多聚赖氨酸处理下 我正在考虑这方面的内容 呵呵 祝成功

上海过客

有一些还在就行了 。  观察的话也只有一部分细胞

yueyongheng

细胞不贴壁有很多种原因：
1 c- q8 K# V9 \3 K+ v* y2 e1、胰蛋白酶消化过度' ~$ H: Z; Q  z8 I1 F6 m
2、支原体污染
. j" r! D3 e# B! }4 R$ r3 r' j3、培养瓶瓶底不干净1 V& [1 U  N0 g$ n4 \
4、培养液PH过碱
, c+ |& a1 T8 O- Y9 E: u& u4 I5、培养液配置、储存有问题: g9 W$ U/ n: I& Z
6、细胞老化
3 l' l& H; D# `  r( u7、接种细胞起始浓度太低或太高9 h9 L$ n/ [1 L* ?% Y. {1 @
PS：仅供楼主参考，请楼主根据自己的实验排查问题所在

chchqq

有道理, V1 d$ X0 ?& l, X) I/ _) u& ~& S