165kd质粒提取

zhao__jc

请问165kd的质粒在提取过程中有没有什么需要特别注意的地方？我用的是碱裂解法，会不会破坏质粒？我昨天提取了一次，结果只得到了很少的一点，每一步都是按操作规程来的，不知哪里出了问题。$ ?) E/ o" r. N: [
   望高人赐教！

lchanlon

165kd?什么意思，是165kb的长度吧，用什么菌株扩增的，可以说明白一点儿吗？这样的大质粒最好去公司买个质粒抽提的试剂盒。用QIAGen的盒子，我以前一个师兄就这样用过！还要注意摇菌时的温度，特别是天气热的时候，如果实验室里条件不好都会引起质粒丢失，最后提不出质粒或量很少，而且摇菌的时间也不易过长。

lixiaodong

一般来说只有BAC才这么大。小的质粒比较tough，对提取条件要求不高。但BAC比较fragile。看看Qiagen的large construct kit，里面对操作及注意事项有详细说明，有可得到非常纯的BAC（我想可作原核注射） QIAGEN_Large-Construct_Kit.pdf (152.2 KB)

2010-8-19 12:54 上传

请用IE浏览器下载
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

。分子克隆实验手册上也有简要的protocol，可在论坛里查到。

shihuijunm

想提浓度好点的东西，可以去公司买好点的试剂盒，像我们实验室有小量的，中量的和大量质粒提取试剂盒，我估计中量的就够你用的。什么加多少菌液，加多少裂解液，加多少什么什么东西等等按照试剂盒来就行。假如你自己配试剂提取的话，可以用冰冷的无水乙醇来沉淀质粒，用PH8的高压灭菌的蒸馏水最后溶解质粒的液体。

weiyepan

165kD=165000道尔顿
  {( c# K7 q+ {" D/ w2 ^1kb DNA=33kD
$ u2 c. N6 i& A) W165kD质粒=5kb质粒
  S& r+ z+ `( C) w$ B6 p$ F直接用碱裂解法就行了，大家都在吹什么啊。。。

weiyepan

质粒量的多少最主要是你的拷贝数有多少。" c# k* B# K5 E% ^
操作流程就按分子克隆做就行了，没什么复杂的。9 r9 I$ V3 j( J+ s: r
最容易出问题的就是你的沉淀剂浓度，如果什么乙醇，异丙醇，PEG的浓度没问题那就是细菌本身的问题了，操作一般没什么问题。

weiyepan

好像记错了，1kb DNA=66kd