造血干细胞在皮肤移植中诱导特异性免疫耐受的研究

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作者：赵海东   肖序仁   张海滨   敖建华   闫同贵   王连元   杨志国   谢蜀生
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1 a* e' @$ i- s. }' D; T: d          【关键词】造血干细胞
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9 }0 r1 q' r) D) U! ~9 v7 M# d　　Zhao Haidong，Xiao Xuren，Zhang Haibin，et al. 　　The466th Hospital of the Peoples Liberation Army of China，Beijing100089. 　　【Abstract】 Objective To find whether the donor-specific tem cell can induce immunolgical tolerance and esˉtablish a simple、effective and practical protocal of inducing donor-specific tolerance.Methods A mouse model of skin transplantation was established.HBC in the donor BMwere collected by StemSepTM（StemSepTMis a negative selection sysˉtem in which the unwanted cells are immunomagnetically labeled and bound to a magnetic column.The desired cells colˉlectedin the collumn flowthrough，have not had antibody bound to their surface）.BALB/C mice were treated with3.5Gy TBI，then were fed50mg/kg CsA.Immediately，treated mice received fully mismatched B6BMC or B6HSC.Within the same day after completing the conditioning regimen，skin transplantation from B6to BALB/C was performed.Survival time of the grafts was recorded.Mixed lymphocyte reaction（MLR）and delayed type hypersensitivity（DTH）assay were perˉformed on day30to examine the tolerance status.Results Time of the grafts survival was significantly prolonged.BALB/C recipients were specifically tolerant to host antigens in MLR and DTH assays，but were still immunocompetent to MHC-disparate third party KM mouse stimulator cells.Conclusion Donor-specific tolerance from B6to BALB/C was achieved in the model.There was no significant difference between BMC group and HSC group.
% Z5 r. a& c( @/ z  i( S2 \2 j# J% i　　Key words haematopoietic stem cell bone marrow cell tolerance skin transplantation
9 g8 O+ W/ f1 ?1 a# s6 Z　　在过去的20年里出现了许多新的免疫抑制剂，然而移植排斥尤其是慢性排斥并未得到完全解决。解决移植排斥最理想的方法是诱导对移植物的耐受。由于同种抗原持续存在是诱导耐受的重要因素，因此最佳的耐受原性同种抗原为有复制能力的活细胞，尤其是骨髓细胞和淋巴样细胞。人们已在啮齿类动物中用输注骨髓细胞诱导免疫耐受，移植物获得长期存活。为了避免可能发生的移植物抗宿主病（GVHD），人们又用骨髓细胞中的造血干细胞来诱导移植耐受。由于经提纯处理后的骨髓细胞中主要含造血干细胞而不含成熟的淋巴细胞，故可避免GVHD的发生。本文利用造血干细胞联合低剂量放射线全身照射和CsA成功地诱导出了供者特异性的移植耐受，未发现GVHD的迹象;并与输注骨髓细胞诱导免疫耐受的方案进行了比较。
0 L) T  C& L5 G　　1 材料和方法9 @& l$ q' h3 L
　　1.1 材料　　1.1.1 实验动物 8～12周龄健康雄性C57BL/6小鼠（H-2 b ，作为供体）和BALB/C小鼠（H-2 b ，作为受体），体重20g左右，由解放军总医院动物部提供。8～10周龄健康雄性KM小鼠（作为第三者），体重20g左右，由北京大学医学部动物部提供。　　1.1.2 主要实验试剂 CsA，口服水剂（Sandoz瑞士）;单抗混合物和磁珠（STEMCELL加拿大），3 H -TDR（中国原子能研究所）。) G7 o' e' {: B9 \; M; m
　　1.2 方法　　1.2.1 皮肤移植模型 采用尾部皮肤原位移植，取供者尾部的环形全层皮肤，长约1.0～1.2cm，移植到受者尾部。每日观察2次移植皮肤的存活情况（色泽、弹性）。凡移植皮肤出现坏死（色泽暗黑、弹性丧失或皱缩时），即认定为排斥。　　1.2.2 供者刺激抗原的制备:（1）骨髓细胞悬液的制备 无菌切取供体股骨和胫骨，PBS液冲洗骨髓腔，离心（1000r/min），加红细胞溶解液0.70%氯化氨1.0ml，离心（1000r/min），PBS液冲洗2次后调整细胞浓度为5×10 7 /ml。（2）造血干细胞悬液的制备:采用免疫磁珠法负筛选系统提取供者骨髓中的造血干细胞;无菌切取供体股骨和胫骨，以含2鸖的PBS液冲洗骨髓腔，离心（1000r/min），调整细胞浓度为5×10 7 /ml后，加入5%正常大鼠血清;每毫升细胞悬液内加入10μl单抗混合物，混匀后4℃～8℃孵育15min，离心（1000r/min），调整细胞浓度为5×10 7 /ml后，每毫升细胞悬液内加入100μl（抗生素的）四聚体，混均后4℃～8℃孵育15min，每毫升细胞悬液内加入60μl磁珠，混均后4℃～8℃孵育15min;将细胞悬液加入提前准备好的置于磁架上的柱子内，以柱子体积3倍的含2鸖的PBS液冲洗，即可收集到造血干细胞悬液。将其离心（1000r/min），调整细胞浓度为5×10 6 /ml。（3）脾细胞悬液的制备:无菌取脾，60目不绣钢网碾磨过滤，离心悬液（1000r/min），加红细胞溶解液0.70%氯化氨1.0ml，离心（1000r/min），PBS液冲洗2次后，RPMI1640调整细胞浓度为1×10 8 /ml。　　1.2.3 实验分组 共分2个实验组和4个对照组，各组样本量6只。对照组为:①生理盐水 皮肤移植;②骨髓细胞（BMC） 皮肤移植;③造血干细胞（HSC） 皮肤移植;④全身照射（TBI） CsA 皮肤移植。实验组分别为:⑤BMC TBI CsA 皮肤移植;⑥HSC TBI CsA 皮肤移植。　　1.2.4 耐受诱导 皮肤移植前，先对受者（对照组④和实验组⑤、⑥）进行低剂量（3.5Gy）放射线全身照射;3～4h后，对受者（对照组④和实验组⑤、⑥） 管饲CsA;接着将供者的骨髓细胞或造血干细胞一次性注入受者（对照组②/③和实验组⑤/⑥）的尾静脉，对照组①则注入等量的生理盐水;并于当天内完成同种异体尾部皮肤移植。　　对照组④和实验组⑤、⑥的CsA用量均为50mg/kg?d（每月1次，从术天当日到术后4d，共用5d）。骨髓细胞和造血干细胞的注射总量为0.2ml，细胞悬液浓度分别为5×10 7 /ml和5×10 6 /ml。　　1.2.5 结果检测 （1）单向混合淋巴细胞反应（MLR）按文献 ［1］方法进行。（2）迟发型超敏反应（DTH）按文献 ［1］方法进行。　　1.2.6 统计学处理 本组资料采用Excel数据库进行统计分析，结果以ˉx±s表达，对各组的计量资料进行t检验，以P3 [: T: `  q' h2 }
　　2 结果　　2.1 各组皮肤移植物的存活时间 正常对照组①的皮肤移植物在移植后11.83±0.98d即被排斥;移植前单纯静脉输注骨髓细胞或造血干细胞（对照组②、③）不能使皮片存活时间延长，与对照组①差异无显著性（P>0.05）。皮肤移植前行低剂量全身放射线照射并在移植后短期（5d）使用非特异性免疫抑制药物CsA，能使移植皮肤存活时间延长，为21±1.26d（对照组④），与对照组①、②、③差异有显著性（P0.05，见表1）　　表1 各组皮肤移植物的存活时间（略）　　注:P值为各组与对照组①的比较。组②、③之间差异无显著性（P>0.05）;组④与组②、③之间差异无显著性（P0.05）。　　2.2 受者小鼠脾细胞对供者抗原的单向混合淋巴细胞反应（MLR） 皮肤移植后30d检查了受者BALB/C小鼠对供者C57BL/6小鼠和无关第三者KM小鼠的单向混合淋巴细胞反应，结果显示:对照组①、②、③三组的BALB/C小鼠脾细胞对C57BL/6小鼠的抗原刺激均表现出明显的增殖反应，但三组之间差异无显著性（P>0.05）;对照组④的增殖反应则明显下降，与对照组①、②、③差异均有显著性（P0.05）。与此同时，移植后30d实验组与对照组各组BALB/C小鼠的脾细胞对无关第三者KM小鼠的抗原刺激均显示显著的增殖反应，但各组之间cpm值差异无显著性（P>0.05）。以上检测结果显示:经造血干细胞或骨髓细胞输注处理后的小鼠（实验组⑤、⑥）对供体抗原刺激的增殖能力特异性显著减弱，而对无关第三者KM小鼠的抗原刺激仍有明显的增殖反应。表明耐受已初步形成（见表2）。 ( o8 e9 z+ w  d" D* V
　　表2 皮肤移植后30d的单向混合淋巴细胞反应（MLR）结果（略） 　　注:P值为各组与对照组①的比较。组②、③之间差异无显著性（P>0.05）;组④与组②、③之间差异有显著性（P0.05）。ˇ为各个组之间比较的P值。　　2.3 受体小鼠对供体抗原的迟发型超敏反应（DTH） 于移植后30d检查了受体BALB/C小鼠对供体C57BL/6小鼠的DTH反应，得到了与MLR检测相似的结果，实验组⑤、⑥的受体小鼠对供体抗原的迟发型超敏反应（DTH）明显减弱，与各对照组差异有显著性（P0.05，见表3）。　　3 讨论
# B9 H! O( {! Y% n　　诱导对移植物的特异性耐受是器官移植界亟待解决的难题。目前各种诱导方案层出不穷，其中利用骨髓细胞或造血干细胞的诱导方案占有重要地位 ［2］。本研究采用小鼠尾部皮肤移植模型，在短期 使用非特异性免疫抑制措施的基础上，经外周静脉输注骨髓细胞或造血干细胞，成功地诱导出对供者特异性的移植耐受。2 h7 a0 b2 z( u/ S/ G
　　表3 皮肤移植后30d受体小鼠对供体小鼠的DTH反应（略）　　注:P值为各组与对照组①的比较。组②、③之间差异无显著性（P>0.05）;组④与组②、③之间差异有显著性（P0.05）。　　本研究结果显示:C57BL/6小鼠的皮肤移植于正常BALB/C小鼠，11d左右即被排斥;移植前行低剂量全身放射线照射并在移植后短期（5d）使用CsA，能使移植皮肤存活时间延长，约21d;在此基础上，于皮肤移植前静脉输注骨髓细胞或造血干细胞（实验组⑤、⑥），移植皮片存活时间进一步延长，达35d左右，与各对照组差异均有显著性（P0.05）。诱导耐受后30d，耐受小鼠对供体小鼠的MLR和DTH保持特异的抑制状态，但对无关第三者KM小鼠的脾细胞仍有强烈的增殖反应，说明在低剂量全身放射线照射加短期（5d）使用CsA的基础上，移植前静脉输注骨髓细胞或造血干细胞可以诱导小鼠获得对供体小鼠组织的耐受，而且这种耐受是具有特异性的。由于该诱导耐受的方案简单、成本相对较低，又与临床器官移植程序接近，使其具有相当的使用价值。本研究结果还显示:输注骨髓细胞和造血干细胞2个方案的耐受诱导效果差异无显著性。可以说明:在骨髓细胞诱导耐受过程中，其中的造血干细胞起着决定性作用;或者说骨髓细胞中参与诱导耐受的有效成分是造血干细胞，人们使用造血干细胞诱导免疫耐受是为了避免GVHD，并且也取得理想的耐受诱导效果 ［3］。然而本文的研究表明:输注骨髓细胞和造血干细胞的2个诱导方案均未发现GVHD的迹象。输注骨髓细胞组没有发生GVHD的原因考虑有2点:一是采用了低剂量放射线全身照射，没有完全去除受者的免疫功能;二是骨髓细胞的输注量少，不足以发生GVHD。由于使用骨髓细胞诱导耐受的成本较造血干细胞低廉，所以在保证耐受诱导效果和避免GVHD风险的前提下，临床应用骨髓细胞更经济。当然，由于该研究样本量少，还需要进一步研究对其进行检验。　　在实验性免疫耐受的研究中，同种异基因皮肤移植是最难获得移植耐受的组织，因此是检查耐受状态与耐受深度的“黄金指标”。在我们的研究中，采用在低剂量全身放射线照射加短期（5d）使用CsA的基础上，静脉输注骨髓细胞或造血干细胞，诱导出对供体特异性的耐受。移植皮肤存活时间获得有效延长，由于本方案中诱导药物普及、诱导方法简单，临床易于采用，使得该诱导方案颇具价值。　　同种异体抗原的输注途径不同诱导免疫耐受的效果也不同。经门静脉输注抗原诱导耐受较之经外周静脉效果好 ［4，5］。实验证明:经外周静脉或门静脉输注BMC或HSC后，均首先在肝脏聚焦，且聚焦在肝脏的细胞为HSC。说明在耐受诱导和维持中起关键作用的细胞为积聚在肝脏中的HSC。我们的研究结果也证明了这一点。在我们的研究中，采用了尾静脉输注途径，也诱导出了供体特异性的移植耐受。因为经门静脉输注抗原在临床应用中也可以做到。对于门静脉耐受或肝脏作为特殊免疫器官在免 疫耐受中的作用尚不清楚，有人认为Kuffer细胞对肝脏内刺激抗原的积聚具有特殊效应 ［6］。有人认为是依靠建立一个长期稳定的嵌合状态 ［7］ 。但其具体机制及肝脏的微环境在门静脉耐受形成和维持中所发生的变化和相关机制等问题仍有进一步研究。 ) B0 ]4 D9 @0 e" Y0 `- g. j& {$ d
　　参考文献　　1 Mayumi H，Himeno K，ShinT，et al.Drug-induced tolerance to allografts in mice（Ⅱ）.Immunobiology，1985，169:147.　　2 赵海东，等.骨髓细胞输注与移植耐受诱导.国外医学?泌尿系统分册，2001，21卷增刊36-40.　　3 Vries-van der Zwan A，Van Der Pol MA，Besseling AC，et al.Haematopoietic stemcells can induce specific skin graft acceptance across full MHC barriers.Bone MarrowTransplantation，1998，22:91-98.　　4 张永法，等.造血干细胞诱导门脉耐受的研究.新乡医学院学报，1996，13（4）:319-325.　　5 A Nakao，T Yagi，H Matsukawa，et al.Combined effect of donor-specific bone marrow transplantation via portal vein and fK506on small bowel transplantation in the rat.Transplantation proceedings，2000，32:2011-2012.　　6 Devito-Haynes L D，Jankowska-Gan E，Sollinger HW，et al.Monitoring of kidney and simultaneous pancreas-kidney transplantation rejection by release of donor-specific，soluble HLA class I.Human Immunol，1994，40:191.　　7 Nostroza J，Munoz P，Espinoza R，et al.Quantitation of solubie HLA class I heterodimers andβ2-microglobulin in patients with active pulmonary tuberculosis.Human Immunol，1994，40:179.　　（收稿日期:2004-08-30）
0 N! Y; A, Q4 d3 s4 P　　作者单位:100089北京中国人民解放军第466医院
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　　（编辑名 兰）