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作者：付尧 ，孔宏亮作者单位：沈阳医学院沈洲医院循环内科，辽宁沈阳110002;中国医科大学附属第一医院循环内科 " u' L3 {5 j) w6 K
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7 y% E# t- \% r: f. B 【摘要】 目的: 探讨碘普罗胺（IP）和碘比醇（IB）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的影响。 方法: 将大鼠骨髓MSCs按2×10 3 /孔接种于96孔板培养48h后，改为IP或IB培养液（碘浓度分别为0、10、50、100、200、500、1000、2000μmol/L）各200μl继续培养，之后于不同时间点测定OD值;另外细胞按8×10 3 /孔接种于24孔板，加IP或IB培养液各400μl孵育3d后，计算细胞活力。 结果: 不同碘浓度IP培养液培养1d、2d、3d和4d不同时间点，各组OD值相比无统计学差异（P>0.05），培养3d时，细胞活力在96.9%～98.2%之间;不同碘浓度IB培养液培养的不同时间点，各组OD值无统计学差异（P>0.05），培养3d时，细胞活力在96.5%～98.1%之间。 结论: IP和IB均不影响大鼠骨髓MSCs增殖，亦不增加细胞死亡。 # j; X/ t$ s: @ O) t) q0 F
【关键词】大鼠;骨髓;间充质干细胞;碘普罗胺;碘比醇* B; d. G' p3 Z0 @( z
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）尤其是骨髓MSCs由于具有自我复制性、非特异的弱免疫原性以及多潜能性而成为当今研究的热点，它可以分化成功能性心肌样细胞、刺激梗死区血管新生、抑制心肌细胞凋亡和防治心肌重构 ［1］ ，因而成为心肌细胞成形治疗（CCM）的基础细胞。但是临床上冠状动脉内输注MSCs前，一般需应用碘普罗胺（IP）或碘比醇（IB）等造影剂，那么骨髓MSCs是否会受到它的影响尚不清楚。本研究旨在探讨IP，IB对大鼠骨髓MSCs的影响。
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1 材料与方法7 D; ]# C+ H3 g! G1 J
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0 |( e( ]) B) V" X 1.1 材料 Wistar大鼠（体重150～200g）购自中国医科大学动物实验中心，IP，IB，标准胎牛血清，即用型多克隆CD44抗体和FITC荧光染料，倒置显微镜和荧光显微镜，细胞孵育箱，高速低温离心机和酶联免疫检测仪等。
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1.2 MSCs分离、培养 将Wistar大鼠用10%水合氯醛（0.3～0.4mg/100g）腹腔内注射麻醉后15～20min脱臼处死，无菌条件下取出股骨及胫骨，剪去骨两端，用6ml肝素化PBS冲洗骨髓腔，将冲洗液加于分离液上离心，之后吸取界面层细胞，用10ml PBS将其吹打制成细胞悬液（共2次），将悬液上清接种于培养瓶中，在37℃、5%CO 2 条件下孵育箱中培养，当细胞约80%融和（约10～14d）时用PBS轻洗3次后加入0.125%胰酶消化2～3min，轻轻吹打、离心后，用10ml培养液悬浮沉淀细胞并按1∶3传代培养，获取第三代细胞（P 3 ）。
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& X& S& U0 l7 I2 N 1.3 免疫荧光检测CD44受体 将细胞按110 4 接种于6孔板培养至80%～90%融合时弃去培养液，PBS冲洗后4%多聚甲醛固定20min，0.1%牛血清白蛋白封闭液封闭30min后PBS洗涤，加入CD44多克隆抗体，室温孵育2h后PBS冲洗，加入荧光FITC标记试剂，室温避光孵育20～30min，PBS冲洗，加入荧光保护剂，倒置荧光相差显微镜下采集图像。PBS冲洗均为三次，每次约2min。
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1.4 MSCs向骨诱导分化 将第三代MSCs进行成骨细胞诱导分化 ［2］ 。按110 4 接种细胞于6孔培养板培养48h，3孔加入H-DMEM成骨细胞诱导分化培养液，另3孔加入正常培养液作为对照，每72h换液一次，14d时采用改良Gomori钴钙法碱性磷酸酶染色，显微镜下观察和拍照。! F: s" K+ ] b
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. d' y5 J' n5 y5 K% \' B 1.5 细胞接种及IP和IB干预 将培养板长轴作为行，短轴作为列，空余一孔（第一行第一列），细胞按210 3 /孔接种于96孔板（共8板）37℃、5%CO 2 条件下培养48h。完全弃去培养液后4板添加含IP培养液（每行碘浓度分别为0、10、50、100、200、500、1000、2000μmol/L）各200μl，另4板添加含IB培养液（碘浓度同IP）各200μl，置于培养箱（37℃、5%CO 2 ）中孵育，每隔2d全量换液。另按810 3 /孔接种于24孔板1板，加IP或IB培养液400μl孵育3d。* q. S" b+ f: ~+ d
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1.6 OD值和凋亡细胞百分比 在IP或IB培养液前1d和2d及孵育1d，2d，3d和4d后，（即细胞培养第3d，4d，5d和6d），按说明用MTT法检测细胞增殖状况，酶联免疫检测仪490nm波长下检测各孔光吸收值（OD值），在计数前3min分别在24孔板的每孔中滴加0.4%PBS台盼蓝溶液100μl，按序随机选取5个不重叠高倍视野（400），在倒置显微镜下分别计数活细胞（未着色）和死细胞（着色）数，按活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数 死细胞总数）100%，求得细胞活力。
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. L$ z4 L# j* d, f2 ~8 j0 [% Z5 w 1.7 统计学分析 数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS12.0软件包进行统计学处理，组间、组内比较均进行非配对样本t检验，检验水准α=0.05，P
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8 T$ d% ^) y9 D& [( d+ i- w 2.1 骨髓MSCs的生成 骨髓单个核细胞P 2 代培养5d时可95%铺满瓶底，呈典型均一的纤维样细胞形态并且CD44染色阳性。加入骨诱导分化液孵育14d后，细胞ALP呈阳性，证实其为骨髓MSCs。2.2 IP和IB培养液对MSCs增殖的影响 具体结果见表1，2。8 a( `- \; Z! |% |% }
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, m4 P) T* C. m, H/ e& }% a; G
' V& C% t, h9 ^; m4 ` L 表1 IP培养液对MSCs增殖的影响（略）
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注:各组间组内比较，P>0.050 k- O; e: O: [& e& ?
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: W; c* E" T, L+ t3 S: ] 表2 IB培养液对MSCs增殖的影响（略）
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* k1 m3 x M% m 注:各组间、组内比较，P>0.05 . p9 Q. Q( `- J; J2 N& i5 O
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$ K! y' o: r6 q, ]* I7 M 2.3 细胞活力的比较 上述碘浓度IP培养液培养3d时，活细胞率分别为97.5%，98.2%，97.7%，97.8%，96.9%，97.3%和97.8%，IB培养液活细胞率分别为97.4%，98.0%，98.1%，97.5%，97.9%，96.5%和97.5%，与对照组（98.1%）相比，细胞活力无统计学意义（P>0.05）。& @2 h' U) I- h( j6 Z, a. C1 J4 i; m
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1976年Friedenstein发现MSCs易于贴附于塑料培养皿上而首创贴壁筛选，该法联合密度梯度离心法可有效清除造血细胞等，成为当前最为有效的分离方法，不过，迄今尚无直接方法鉴定MSCs，其鉴定均通过培养过程中出现分化表型 ［3］ 等特性逆推得知是否为MSCs。而本研究采用CD44 标记来检测是否分化为成骨细胞，在国内尚未见报道。
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! w' D0 l5 A- [2 w8 X IP和IB是目前国内常用的造影剂，二者均为非离子型、低渗透压并溶于水的含碘造影剂。IP血管内给药后，不论剂量大小，5min后，约28%±6%出现于血浆中，并可迅速分布至细胞外间隙，因其代谢较快（t 1/2 =2h），注射后24h内，清除约92%，72h一般可完全清除 ［4］ 。而IB药代动力学近似于IP。应用广泛。
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本研究发现IP和IB在各个时间点对骨髓MSCs的增殖不具有统计学差异，并且各种浓度培养3d时活细胞率亦不具有统计学差异，即不增加细胞死亡。提示IP或IB不影响大鼠骨髓MSCs的增殖。而是否影响骨髓MSCs多潜能性尚需进一步研究。
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【参考文献】9 O7 ^. b4 p4 N4 n {: [
［1］ Mark F P，Bradley J M.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics ［J］.Circulation Research，2004，95:9.
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［2］ Jaiswal N.Osteogenic differentiation of purified，culture-expanded hu- man mesenchymal stem cells in vitro ［J］.J Cell Biochem，1997，64:295-312.
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9 ]9 l7 n9 U, F0 o h 3 l p5 U0 U% C% V6 L) M3 D
- o& W& ?: g6 y! u A: P ［3］ Pittenger MF，Mackay AM，Beck S C，et al.Multilineage potential of adult human mesenchmal stem cells ［J］.Science，1999，284（5411）:143-147.
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+ u- m6 I& J* o. s y% u ［4］周玉杰，霍勇，卢才义，等.心脏病介入治疗疑难问题———造影剂［M］.北京:中国协和医科大学出版社，2005.43-54. |
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