做MTT遇到的细胞均匀的问题

djl

我最近在做MTT测蛋白促进细胞增殖的实验，对照组测出的结果，有的高有的低（没有污染），老师说我的细胞铺的不匀，怎样才能避免这种人为造成误差的现象。

have-a-rest

算好体积，细胞混匀后，最好的办法是用排枪！* F) |2 \) X+ \  D" s
万一没有排枪，参照上述战友经验。

djl

有道理。谢谢

panda44

其实我也不是特别懂# Q6 s9 X0 a- Q
, s% d0 `8 Q5 g# ~2 i
但是有几种可能：1.传代时，细胞没有再吹打均匀和同等细胞密度的情况下，传到皿里面
& S: e% J8 Y+ D) [" o; @' Q' L                2.接种时，你接种到96孔板时消化完以后要收集到一个容器内，吹打混匀再分别接种到孔内。0 G+ j  [" g/ l5 q/ W2 G
                3.还有个我觉得有些实验室是有点难避免的，就是在用枪吸出加有mtt的培养基时，容易贴到板底，这样就容易刮刀板底的结晶。我猜是这样的。
+ S. `0 o( f7 S3 d0 y' a, ]% K0 I4 ]' i5 y
不知道说的对不对，仅供参考啊

fespysok

吹打的过多对细胞是有损失的，我取心肌细胞铺96孔板时，调整好密度后，分在5ml的离心管中，每管加细胞时适量吹打几次就好了，这样铺出来的细胞还是蛮均匀的！

sailboat

在铺板前，在离心管里面吹打多次（100次左右），然后铺板，我是这样做的，还行。不知道是否帮到你？
. X: r3 n3 ^: A, o" T* ?- e- j" Rrmbly 发表于 2010-9-1 18:32

  F5 t( N8 Q' C2 H3 Q/ x" G  O. a
! h) v# c7 \0 J  a. z& p
    100次？会不会太多了 而且会让细胞受到很大影响

echo

我个人的经验是每次加细胞时，要每加几孔就充分吹打细胞，同时加液要快。
2 I; z# [( z' {7 ^另外，也可以检查一下实验中有没有其他方面出现状况，这样的结果不一定只是细胞量不均匀造成的，比如我曾经遇到过因为移液器出现问题，加液量不均匀引起平行孔之间OD值差别较大。

djl

回复 2# rmbly
( y6 j9 k6 I9 l5 J; G' ]4 d& ~# i  C
' C/ G5 c% g8 f! K( q. l
    谢谢

djl

回复 4# guosapphire
' o. s6 }+ k- C) z
4 i2 q! w$ Q6 i7 }
" E; U9 e6 L& `5 U) l7 H    谢谢，我们的培养箱确实不平，我每次把板放在中间倒是可以避免细胞分布不匀的现象。我现在最大的困惑是，每孔的细胞个数不匀。以对照组为例，用酶标仪测完OD值，有的在0.3到0.4之间，有的在0.4到0.5之间，或者更高。

风再吹起

我是这样种的:96孔板，每板做60孔，每孔100微升
. l1 j  p. v7 J5ml左右的培养液消化1瓶细胞，吹打均匀后计数，
6 K2 m* c8 ^0 l& e: _根据计数结果，再次吹匀，均匀分到7ml离心管（种几块板就分几只，这样每板细胞总数就一致），每只0.8、1.0、1.5ml都行，反正最后每管定容到6.5ml（按65孔每孔100微升计）后，就是需要的细胞密度。
4 Y5 [: U5 H9 K吹匀后就可种，竖着分组就要横着种，而且是从1~10然后是20~11的来回种，反之亦然。每种一孔用枪吹3下，每种一行用大枪或吹打管多吹几下，因为细胞沉得很快，最后几行液体不多了可以不用大枪吹了。这样每一孔细胞数就基本一致了。3 |/ M" _/ a8 }. d7 Q
种的时候让枪打出稳定、柔和的水流（不能激起漩涡，不然细胞会扎堆），同时转动手腕，贴孔壁画1~2圈，刚好打完100微升，培养液沿孔壁流下，自然就铺的比较均匀了。有人用晃板的方法，个人觉得不适用于96板，后面种完前面一沉底了，晃只会让细胞更扎堆。' ~' w: l: o: J* G8 {. A  D0 _& l+ k
3 e! ^, ^1 u) Q' y  `! l2 P
要注意的是：. `6 N, w+ s+ x, s7 n6 T
每一步都要留余量，比如种60孔，准备好65孔的量，因为没一枪会有误差，只准备60孔，最后一孔细胞会不够。万一出现这种情况，如果细胞瓶里还有，根据稀释比例，还有的补救。4 O/ n$ U( {0 L0 ]! m
整个过程下来，细胞不知道要被吹多少下，所以吹打要轻柔，不要有泡，还要防止培养液从离心管里吹出来。