求助：大家帮忙看看，我养的间充质干细胞怎么长不起来啊？

stefan

向各位师兄师姐请教：我养狗间充质干细胞已经一个月了，可是一次也没成功过啊！希望能的到大家的指点！下面是我的培养过程：
! y! o9 {3 p% k4 J, x5 @5 B) r每次常规消毒取骨髓10ML左右，用肝素抗凝，然后用密度为1.073的percoll与骨髓1:1混合4000转，30分钟，4度离心，每次能得到单核细胞层，然后PBS离心洗涤2次，接种于25cm2塑料培养瓶中，接种时在镜下观察可见大量细胞。然后放入培养箱养3天，然后换液，首次换液，我并没有用 PBS洗涤，直接将培养液加入培养瓶中，然后培养2天，第2次换液开始就用PBS洗涤2次，再加入培养基，如此重复。我的培养液用的是hyclone 的液体培养基，胎牛血清是四季清的，用的是20%的浓度，用前加入谷氨酰胺和双抗。
5 X. J% d8 _  B7 g) y在培养期间我也尝试园子里的前辈用的直接贴壁法，骨髓取来后直接加培养基接种于培养瓶中，1小时后首次换液，首次换液时也没用PBS洗涤，镜下观察可见大量贴壁细胞，但是第二次换液后，也很少见贴壁细胞，现在搞得我很郁闷啊。+ z5 _& U, G( M5 s' J* M
我的问题就是:原代培养时可以见着大量的圆型细胞，但是换完液后，基本上很少看见细胞，偶尔有一些细胞，其形态都是圆型为主，与典型的间充质细胞梭形结构完全不同，不知道这些圆形细胞是不是间充质干细胞，怎么换完液之后就很少有细胞长起来了啊，不知道是什么原因？还有就是接种密度过大也影响细胞的生长？再有就是10ml骨髓一般能接种几瓶培养瓶，我一般是接种5瓶左右？（25cm2）0 n1 ~, A7 t9 k; z/ X
希望大家能帮忙给点意见,谢谢了！！

民族围观英雄

回复 2# angel-sakura " J2 \7 A& A7 m4 I3 E" h
1 ]4 U' i: }- q1 B8 ]; a
' O; L; d3 S: w; V
    2楼好

stefan

谢谢各位的的指点啊，过两天再取材试试，有成果后向大家回报情况！

zhanglei1414

原代培养时可以见着大量的圆型细胞，但是换完液后，基本上很少看见细胞，偶尔有一些细胞，其形态都是圆型为主，与典型的间充质细胞梭形结构完全不同，不知道这些圆形细胞是不是间充质干细胞，怎么换完液之后就很少有细胞长起来了啊，不知道是什么原因？
! W4 N2 Z9 _" V2 H$ |) U7 d& L% K# `8 ]- b- m7 X! z, v$ l  ?5 \3 n
1，圆形为造血细胞，2，换液不要吹打，MSC贴壁不牢，容易吹掉或晃掉，3,72小时半量换液，3天后全量换液，4，MSC先贴壁，造血细胞贴在MSC上面形成坟堆状的细胞集落
1 O, s; S1 E0 \. Q& ~
" [: Z5 U7 n0 N" I- k# _* {- c5 x还有就是接种密度过大也影响细胞的生长？再有就是10ml骨髓一般能接种几瓶培养瓶，我一般是接种5瓶左右？（25cm2）! E2 `" [3 S0 e

! c2 e0 I, V$ d+ t9 |细胞密度不宜过大，大量的红细胞也影响贴壁，可离心去掉红细胞，吸白膜层，3-4毫升骨髓离心后的白膜层能形成较多的细胞集落

babyzeng

直接贴壁法我们都是24小时后换液的。而且细胞密度很高大概是5*10的六次方左右。不过我们是做大鼠的，贼啦啦的贱，没两天就得传代。

angel-sakura

7 w+ {! G/ X  d* H) T5 V这个是经典的直接贴壁法protocol; [8 ^4 ]( h9 S& l; z' M+ F
第一次换液上面说的是3h