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发表于 2009-3-3 12:23 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

作者：石爱平  许宁  范志民  张哲  王广义  王有德作者单位：吉林大学第一医院乳腺外科，吉林  长春  130021
   : Y9 i& T$ `2 c% N* |

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                     3 z7 w% A3 h4 o# [- x) y
         . z4 E( n3 z" t1 A7 U$ c

         , u0 d7 P. D+ l- J/ n' }

      & `5 ]  }! h$ q# ]8 R6 P
      , M: b# m" d4 N: [+ s6 x

      【摘要】  目的  探讨成人乳腺干细胞的分子特点。方法  应用RTPCR和免疫印记杂交方法，检测从乳腺癌旁正常组织中分离培养的具有乳腺干细胞特点的乳腺上皮细胞（SHMEC）及同源癌组织中乳腺癌相关基因Cmyc，Cjun、Ras，CerbB2的转录和表达。结果  SHMEC不转录癌基因Cmyc和Cjun，不表达CerbB2及Ras癌基因蛋白，而其同源癌组织中可检测出癌基因的转录或表达。结论  成人乳腺干细胞SHMEC，不具有恶性转变的分子基础，有重要的研究价值及临床意义。
      【关键词】乳腺干细胞癌基因乳腺癌
   　　Research on the transcription and expression of the genes related with breast cancer in the adult mammary stem cells/ \1 M# N7 q! Q1 D9 a! }2 Y

　　SHI AiPing，XU Ning，Fan ZhiMin,et al  O5 U6 B7 N5 K, H2 H: e

　　Department of Mammary Surgery，The First Clinical College，Jilin University，JiLin，Changchun 130021，Jilin China

　　【Abstract】ObjectiveTo explore the molecular characteristics of adult mammary stem cellsMethodsSome oncogenes in sample of primary neoplasm and a kind of special human mammary epithelial (SHMEC) with stem cells properties derived from the normal tissue surrounding breast carcinoma were detectedThe transcription of Cmyc and Cjun and expression of CerbB2 and Ras in SHMEC and breast cancertissues were measured by RTPCR and Western BlotResultsThe transcription and expression of four kinds of oncogenes in SHMEC were not detected while they were detected in tumor tissueConclusionsMammary stem cells SHMEC are not to be the molecular foundation of abnormal proliferation and differentiation or have no hint of being malignant，having important research value clinical significance9 D1 G8 _- K: P# g6 k
9 e" L1 M' Z. z7 p2 u
　　【Key words】Mammary stem cell;Oncogene;Breast neoplasma$ d  R$ U& d4 ]  \
% U' t* v- |, B

8 H3 H1 R, y7 k- p" w
　　乳腺干细胞的研究为乳腺再造及乳腺癌发生机制的研究提供了很好的模型系统。2002年3月，丹麦科学家Peterson〔1〕研究小组从缩乳术切除的乳腺组织中分离并建立了乳腺干细胞系。研究证实〔2〕，从乳腺癌癌旁正常组织中可以分离、培养出一种具有干细胞特点的成人乳腺上皮细胞（SHMEC）即乳腺前体细胞。因为乳腺干细胞最终将用于乳腺再造及乳腺癌发生分子机制的研究，很有必要对干细胞的癌基因、抑癌基因及染色体变异情况进行了解，而且，目前的一些观点认为肿瘤起源于肿瘤干细胞。但来源于癌旁组织的干细胞是否具有癌变的分子基础，尚未见文献报道。为确定来源于乳腺癌旁正常组织的SHMEC是否与同源癌组织有相似的基因变异特点，即是否具有恶变的趋势，本研究应用RTPCR和免疫印迹杂交方法，检测了几种乳腺癌相关癌基因及抑癌基因的转录和表达。

　　1材料与方法

　　11材料标本来自吉林大学第一临床医学院，非家族性乳腺癌患者乳癌根治术获得的肿瘤组织新鲜标本，经病理证实为乳腺癌组织。SHMEC细胞从乳腺癌癌旁正常组织中分离，培养〔2〕。3 U+ g5 I0 A3 w3 N

　　12方法; w- P! l1 o8 _7 ^/ u; d6 q" y

　　121SHMEC细胞基因分析+ V* O5 ]  G( j  M5 O$ d' Y
% D) ]! \. K1 S9 _& A* K
　　1211逆转录PCR方法检测SHMEC细胞及同源癌组织的Cjun、Cmyc基因：（1）引物设计与合成。由北京鼎国生物工程公司合成纯化。Cmyc引物序列：5'CCCAGCGAGGACATCTGGAAGAA3'，5'GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC3'；Cjun引物序列：5'GCATGAGGAACCGCATCGCTGCCTCCAAGT3'，5'GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCACACT3'；βactin为标准内参照：5'ACCCCCACTGAAAAAGATGA3'，5'ATCTTCAAACCTCCATGATG3'。（2）半定量RTPCR实验流程。取100 mg癌组织，切碎研磨匀浆备用；收取SHMEC细胞约2106，离心沉淀。在组织和细胞中，分别加入2 ml裂解液（4 mol/L异硫氰酸胍，20 mmol/L NaAC pH52，01 mol/L β巯基乙醇，05%十二烷基肌氨酸钠），完全溶解后，4℃下12 000 r/min离心5 min，弃沉淀；用抽提液（酚：氯仿：异戊醇 = 24：24：1）抽提3次，加入500 μl 预冷75%乙醇，振荡混匀，4℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清；室温晾干，加入DEPC水溶解备用。向每个Eppendorf管内加入反应体系10 μl，包括RNA 1 μl （约1～2 μg RNA），dNTP 2 μl，MgCl2 05 μl，RP（随机引物）1 μl，反转录酶1 μl，10Buffer 1 μl，dd H2O 35 μl；37℃下温育30 min，95℃ 5 min终止反应。cDNA扩增反应体系（25 μl）包括RT反应液10 μl，dNTP 2 μl，特异引物15 μl，Taq DNA聚合酶1 μl ，βactin引物1 μl，10Buffer 15 μl，dd H2O 8 μl，加入10 μl石蜡油，离心混匀，将EP管放入PCR仪，95℃ 5 min；温度循环94℃ 05 min，55℃ 1 min，72℃ 05 min，共35个循环。取10 μl PCR扩增产物在12%的琼脂糖凝胶水平电泳上做扩增产物检测分析，电压50 V，05 h，溴化乙啶染色。紫外光下拍照，比较各组电泳带之间差异。经凝胶扫描测IOD值，比较不同细胞目标基因的转录水平。
+ j" d: {( c3 ?2 U+ J8 y5 L
　　1212Western blot方法检测SHMEC细胞、同源癌组织的CerbB2（p185），Ras（p21）基因表达〔3〕。用凝胶加样缓冲液裂解细胞。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳。电转移法将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体，对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色丽春红S染色，封闭液封闭硝酸纤维素滤膜的免疫球蛋白结合位点。第一抗体和靶蛋白的结合，用1：1 000抗细胞角质素19（K19）、CerbB2（p185）、Ras（p21）的第一抗体与硝酸纤维素滤膜共温育，用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶共价偶联二级抗体与硝酸纤维素滤膜温育的方法同上，经磷酸缓冲盐溶液最后一次洗涤．发光显色(按试剂盒说明)。拍摄滤膜照片留作永久实验记录。+ F  d8 F! H9 _$ t
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　　2结果* H: F5 f. Y; U0 W- r

　　21SHMEC细胞不转录Cmyc和Cjun癌基因而同源癌组织转录该两种癌基因。经凝胶扫描测定IOD值，相对IOD值=目标基因IOD/ actin IOD，比较不同细胞目标基因的转录水平。同源癌组织转录Cmyc和Cjun基因的相对IOD值分别为0156 7和0154 6，而SHMEC转录Cmyc和Cjun基因的相对IOD值分别为0003 0和0003 1。
3 q1 X% T6 i- r3 e! s
　　22SHMEC细胞不转录p185和p21癌基因而同源癌组织转录该两种癌基因（见图1）。
3 k' o6 X( }  c5 i$ g
　　图1CerbB2 蛋白(p185)和ras 蛋白(p21)在SHMEC细胞（S）和同源癌组织（T）的表达（略）

　　3讨论

2 R$ L3 |6 F  a: {, X9 N

　　干细胞为肿瘤分子机制的研究提供了一个合适的工具。在肿瘤发病学学说中，“细胞分化阻滞”学说得到多数学者的认同〔4〕。干细胞是组织器官中最原始的未分化细胞，研究其在增殖分化过程中，何种因素导致恶性转化，以及在转化过程中，各种调控基因的变化，将有效地模拟肿瘤的发生过程。/ F; n5 G0 A/ b! N( e" H
5 V% U+ ^1 F* [7 M# ?
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3 i/ q/ ?2 X% E, D
　　乳腺癌基因扩增通常涉及癌基因及几种生长因子受体基因: CerbB2、Cmyc、Ras、PRAD/CYD1、INT2、PKW、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）FLG、BEK、类胰岛素生长因子受体等〔5〕。

% ]7 O3 N+ d) i# U) G

　　本研究检测了4个变异发生频率较高，并已证明有重要临床意义的乳腺癌相关基因：Cjun为立早癌基因，在乳腺癌发生的始动阶段发生作用。Ras，Cmyc和CerbB2控制细胞的增殖和分化，是促进肿瘤发展、恶化的重要因素。研究发现，正常乳腺组织、囊性乳腺增生组织、乳腺癌组织Cmyc mRNA表达水平逐渐升高，Cmyc基因过度表达在乳腺组织癌变过程中起重要作用，是判定临床预后和肿瘤复发的分子指标〔6〕；CerbB2基因扩增及蛋白表达与乳腺癌的病理组织学分级、临床病理学分期及预后判定有显著相关性〔7〕；Ras基因为第一个被分离出的人类癌基因，已证明Ras/p21表达水平随乳腺癌肿瘤体积、局部浸润和淋巴结转移的扩展而升高，提示Ras癌基因活化可能在乳腺癌发生、发展中持续起作用，并且与肿瘤的临床进展、术后复发密切相关〔8〕。* s! ]# J9 V3 w- p: U, D

! L' ~6 A; M$ A5 a
- t1 C. n7 A- r$ [+ W/ t( s, p9 m
　　本研究用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）方法，检测癌基因Cjun，Cmyc的转录水平，用免疫印记杂交方法，检测CerbB2/p185基因和Ras/p21基因的表达，在SHMEC细胞中未检测到Cjun、Cmyc基因的转录及p185、p21蛋白的表达，而在相对应的同源癌组织中检测到这些癌基因的转录及癌基因蛋白的表达。提示在乳腺癌旁正常组织中存在的乳腺干细胞SHMEC，不具有异常增殖、分化的分子基础，或者说不具有恶性变化的趋势，是接近正常的细胞，可以用于进行乳腺癌分子机制及乳腺再造的研究。

4 b- Q/ B3 S) h$ w
      【参考文献】2 p: Q6 ^' j0 n" @( l
　　1  Gudjonsson T，Villadsen R，Nielsen HL,et alIsolation immortalization and characterization of a human breast epithelial cell line with stem cell properties 〔J〕Gene Development，2002;16(6): 6937062 f/ b5 i+ x( k
( }. n& J( r. C

) a4 K5 H- G, \$ m1 T
　　2  石爱平，许  宁，王有德，等成人乳腺前体细胞的分离及鉴定的研究〔J〕中国药物与临床杂志，2003；3（1）: 58

- Z# L6 F8 f1 Y$ N
! H" ^; y4 [1 W. i2 Z7 t* T9 K
　　3  萨姆布鲁克 J，费里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T,等分子克隆实验指南〔M〕第2版，1989: 88898
  y  x0 j9 j1 d' j. y' \
, V1 p6 _* q! p; F( a, k

　　4  Markert ClNeoplasia: a disease of cell differentiation 〔J〕Caner Res，1968；28: 190814( {/ c+ P+ x+ }4 f
) N9 D- f1 I& {
  L2 d: d/ y' f7 X+ {( k0 l+ P
; r$ V5 t; t, W4 D2 U$ d4 I& \
　　5  Forozan F，Veldman R，Ammerman CA,et alMolecular cytogenetic analysis of 11 new breast cancer cell lines 〔J〕Br J Cancer，1999；81(8): 132834

　　6  Claus MS，Ulf V，Ulrich BZ，et alCmyc，not HER2/neu，can predict recurrence and mortality of patients with nodenegative breast cancer 〔J〕Breast Cancer Res，2003；5: 306

6 J5 A. P( D$ X$ ^8 ^; Q! H
7 S! E6 l* A) a7 q/ z6 h5 k0 d7 e
　　7  Szillosi J，Balazs M，Feuerstein BG,et alERBB2(HER2/neu)gene copy number p185HER2 overexpression and intratumor hetergeneity in human breast cancer 〔J〕Cancer Res，1995；55(22): 54007

. H, j& Q5 Z8 r0 b( ~& E
6 u0 v" Q2 ^/ p
　　8  Timothy C，Willian R，Miller D,et alPrognostic significance of expression of a ras protein with a molecular weight of 21,000 by human breast cancer 〔J〕Cancer Res，1987；47: 52903

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