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作者：张喆 刘宝华 李嗣杰 石爱萍 刘国津作者单位：吉林大学第一医院乳腺外科，吉林 长春130021 ; M7 M8 M; l1 y9 ~4 v/ @( B" ^. P
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' R8 O/ ~+ y- r) t! A$ t* q 【摘要】 目的用不同的鉴定方法对应用免疫磁珠技术分离的乳腺干细胞(separated human mammary stem cell，SHMEC)进行生物学特点的鉴定。方法 对原代培养的乳腺细胞用免疫磁珠方法(Magnetic Cell Sorting，MACS)进行分离。对分离后的乳腺干细胞（SHMEC）进行免疫组化，光镜，GIEMSA染色，染色体染色，电镜超微结构扫描等方法进行生物学特点的鉴定，并观察其转化为其他乳腺细胞的能力。结果 光镜下可见对正常的静止期的乳腺细胞经免疫磁株分离后得到的乳腺导管上皮细胞呈椭圆型，聚集成团。GIEMSA染色可见红色椭圆型细胞及细胞核。扫描电镜下可见细胞的超微结构特点。染色体核型分析染色显示SHMEC细胞为二倍体细胞,染色体数目与正常外周血淋巴细胞相同。染色体恒定,无缺失及短臂丢失。结论 从正常组织中经原代培养后分离出的乳腺上皮细胞具有乳腺干细胞的特性并不具有恶性转变的生物学特点。 0 k+ o; u+ z1 x$ ?# P5 H
【关键词】乳腺干细胞；电镜；染色体染色# A7 W- ]( D! A- ^' R
乳腺干细胞是成体干细胞的一种，其具有自我更新和分化为其他细胞系的能力。可作为乳腺癌术后再造的重要材料，因其安全性及经济性让乳腺干细胞的研究成为目前国外热点研究项目。但是由于乳腺干细胞相对于其他干细胞不好提取分离，而且很容易分化为其他的乳腺细胞，所以目前国内对其生物学特点及相关的鉴定方法报道的很少。本实验从乳腺癌癌旁正常组织中培养，利用免疫磁珠方法分离出一种具有干细胞特点的成人乳腺上皮细胞，并通过不同的方法进行生物学特点的鉴定，证实了它的干细胞特性。为下一步进行分子生物学基因方面及蛋白方面的研究奠定了良好的基础。
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1材料与方法1 ~# p% Y# ?! R ^& r6 \
6 T" R* \2 O7 k, o/ J- c 11材料1 p. @9 A. @: K6 K1 ~ y$ b& ^9 [
5 O6 ~7 ?0 T+ J" e9 Z# q 所用组织均取自本院乳腺外科手术中所切除的乳腺癌患者癌旁的正常乳腺组织（经病理证实无肿瘤浸润），取材患者为女性，年龄45～55岁，术后病理均为乳腺导管浸润癌。0 g% ?' K' @; \" g* m
1 A& A( ]6 u" u 12 主要试剂及仪器
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DMEM/F12培养基（Gibco公司），10％胎牛血清（Hyclone公司），025％胰蛋白酶（Sigma公司），04 mg/L氢化可的松， 10 mg/L胰岛素，50 mg/L青霉素，100 mg/L链霉素，25 μg/L表皮生长因子，2 g/L的I型胶原酶，CO2培养箱，超净工作台，倒置显微镜，扫描电镜。
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; p s& ^. i* ^6 h 13方法% N, o, V6 u: f# o* H+ T
5 p7 E! O* M: r w* w 131 乳腺细胞的原代培养
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4 @/ V) t' z+ I9 B @- _# _ 用无菌剪刀去除脂肪组织，在培养皿中反复用生理盐水漂洗，然后剪碎成大小为05 cm3左右的组织块，加入I型胶原酶5～10 ml，置于培养箱中24 h。第2天将消化后的乳腺组织取出，倒掉组织块，将液体经离心后去上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基于培养瓶中，各培养瓶编号后置于37℃，体积分数为005的CO2培养箱中培养。3 d后换液，以后每2 d半量换液一次。约2 w后原代培养的细胞接近铺满整个培养瓶的表面时，即可用025％胰蛋白酶加1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃，3～5 min）然后按1∶2传代。将传代的人乳腺细胞悬液以1105ml-1接种于25 ml培养瓶培养。
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0 y$ ?; u) q6 {: _& B. i& z/ f) c 132 乳腺干细胞的分离筛选3 h! k) x& ~# P) ~
7 d' i* z( b0 b0 J. R5 W4 v 取原代培养的SHMEC细胞，经025%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后用无菌PBS洗1次，调细胞浓度为1108ml-1，加入MUC抗体10 μl，4℃，放置30 min。取细胞悬液80 μl加入标记有羊抗鼠抗体的免疫磁珠20 μl，混匀后置于4℃冰箱中孵育15 min。加2 ml PBS(300 r/min)离心10 min，小心吸去上清，用500 μl PBS重悬细胞。将磁分离柱置于分离仪上，从分离柱的上端加入500 μl PBS，PBS流出后弃去。将500 μl免疫磁珠标记好的细胞悬液加入分离柱，当细胞悬液流经分离柱时， MUC阴性细胞流出分离柱。收集磁柱上的细胞加入ESA抗体10 μl，4℃，放置30 min，重复上述过程，ESA阳性细胞因标记有免疫磁珠，在磁场作用下阳性细胞留在分离柱中。将分离得到的MUCESA 细胞加入培养基置于37℃、5%CO2孵箱中继续培养。并将一部分细胞加入Laminin培养基后放入24孔板中进行三维结构的培养。
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W9 u) d$ U: z- h& c. Z 133 乳腺干细胞生物学鉴定: b( D) a5 J$ a* q
. d* o0 G S! u' _4 m1 S( G) }. @ 运用倒置显微镜连续动态观察细胞生长及形态特征并增殖计数。每天连续观察24孔内的细胞。将乳腺干细胞悬液以1105 ml-1接种于预先置入盖玻片的6孔培养板，直径35 cm，各孔加入2 ml培养液。培养第7天，取出盖玻片，4％多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗；3％H2O2消化内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗；加入鼠抗人CK19单克隆抗体；湿盒4℃过夜；37℃复温1h，PBS冲洗后滴加生物素连接二抗，37℃孵育30 min；PBS冲洗后DAB显色，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。按文献〔4〕的方法制片,对分离后的乳腺干细胞进行GIMESA染色。在显微镜下观察细胞特点。过二甲苯2次后，用中性树胶进行封片处理，将分离出的乳腺干细胞加入秋水仙素，加入培养液继续孵化6 h左右。采集分裂细胞〔4〕，经离心低渗处理，加入固定剂5～10 ml，再次离心后用滴片法制片。并且任取30个细胞行染色体计数。后仍用GIEMSA染色方法染色，观察染色体情况，后封片处理。将放入24孔板中的细胞接种于盖玻片内，4％戊二醛固定后，用丙酮脱水，用乙酸异戊酯置换，干燥，在扫描电镜下观察。2 t. V2 o9 g8 L$ W* h' H
; c; A2 f, u& R1 m; A! s# E 2 结果& ]* \. Q2 F# @; t0 ?. @, t' u
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21 光镜观察结果" p* f6 p9 _% D1 s+ R
; @' \) H0 N0 G6 R1 w' d* ?! s 细胞呈椭圆型，细胞核可见偏于细胞一侧，可占整个区域的60％左右，胞核强嗜碱性，胞质较少，呈弱酸性。24孔内的细胞在Matrigel培养基内行成三维结构，并可见乳腺导管样结构（图1）。6 n+ I1 E' X; \$ d
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22 免疫组化检测结果
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0 U4 o9 J& c+ j' `7 c 经免疫磁珠分离的乳腺干细胞行CK19抗原免疫组化染色，可见大部分细胞染色阳性( 图2)。
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( b: Z; R1 L$ b1 k* b; x 23 GIMESA染色结果
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) |/ S, X/ L& M/ ^; U5 G 可见大部分细胞为阳性表现，其余细胞呈青灰颜色，乳腺干细胞为粉红色，细胞特点与光镜观察的结构特点相似（图3）。
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24 染色体染色后核型结果1 _# T' {( v0 {/ k: j
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乳腺干细胞为二倍体细胞,染色体数目与正常外周血淋巴细胞相同。染色体恒定,无缺失及短臂丢失。
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6 o+ T1 T: p6 n3 l( N5 r* a 25 电镜观察结果' s2 O. P* a8 q) u
; d$ V! [+ J- O. J1 S2 r 电镜下可见细胞的结构呈大而圆的形状，相邻比较紧密。细胞核偏于一侧，呈椭圆型，胞质内有大小不等的脂滴，有的脂滴呈空泡状，线粒体及粗面内质网丰富，高尔基体位于核的周围。
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# Y. O" T* I; D, f2 u% C: ?& R 3讨论
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人们研究乳腺细胞系始于本世纪80年代，在光学和电子显微镜下对乳腺各种细胞的形态充分认识的基础上，美国、英国及欧洲等国的Ben、Nandi、Hackett、Furmanski 几个实验室成功进行了乳腺多种上皮细胞的混合培养，称为“organoids”，之后经历了单细胞克隆，克隆细胞不死化，细胞分化诱导等发展过程。2002年丹麦 Peterson〔1〕领导的小组首先宣布，从缩乳术的乳腺组织中，利用免疫磁珠方法分离培养了成人乳腺干细胞，并证明其有分化成乳腺各种上皮细胞及形成乳腺腺体结构的能力。目前国外对乳腺干细胞的研究主要集中在其培养、分离方法，生长特性，蛋白功能〔2〕等方面，国内在这方面研究很少。 免疫磁珠方法是分离细胞的一种可靠方法，其原理是通过已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱上，实现阳性细胞分离及阴性细胞的分离。本实验通过对正常乳腺组织细胞的原代传代培养，免疫磁珠方法（MACS）分离后得到一种具有干细胞特性的乳腺细胞文献认为，当乳腺干细胞逐渐分化成导管上皮细胞及肌上皮细胞后，可以由CK19阳性细胞逐渐转成阴性细胞。分化出的导管上皮细胞CK19染色阳性〔3〕，与本实验的免疫组化结果一致。经GIMESA染色〔4〕后进行的染色体核型分析标明，本实验分离出的细胞染色体数目与外周血正常淋巴细胞的相同，染色体恒定,无缺失及短臂丢失。在DNA方面说明了此细胞并无恶性变的趋势。另外，乳腺干细胞还必须具有分裂潜能的基本特点〔5〕，细胞是否已经处于分化状态很容易鉴别:细胞质中有多少细胞器;细胞器发育的程度如何;是否含有特异性蛋白质;最重要的是细胞是否有极性;是否含有大小和数量不等的脂滴;是否有大量的高尔基体和粗面内质网等等,都是判断细胞是否分化的直观标准。Matrigel（基底膜基质）是从EHS（EngelbrethHolmSwarm）小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物，此种肉瘤富含细胞外基质蛋白。其主要成份是Laminin，还有胶原Ⅳ、硫酸肝素糖蛋白和其他的一些生长因子。Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与细胞基底膜类似。本实验将分离后的乳腺干细胞在含有Laminin的培养基中进行三维培养，最大限度模拟了细胞体外培养的细胞内环境。观察到了细胞形成的乳腺导管样结构，并通过扫描电镜观察到此细胞的内在超微结构。证明了经培养分离的乳腺上皮细胞具有乳腺干细胞的分化特性并具有转化为其他乳腺细胞的能力。5 ~' x- X3 D) g6 K8 S# M
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（30300336）
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发表于 2009-3-3 12:25
