请教：神经球免疫组化protocol

smkx

哪位高手可以贡献下神经球免疫组化protocol参考下，非常感谢！

yuerenxi

有没有找到，我也想要这个东东呢

xiaodiao123

我也想知道

jennyshy

1.0.1mg/mL 多聚赖氨酸（PLL）包被培养皿 37℃ 至少3h(最多2d).! W+ ^. m, d+ U/ S& e8 I
2.弃PLL，晾干后PBS洗三次，晾干# a( A" g/ T" n( @$ m9 z
3.种入神经球，完全培养基（若贴壁效果不好，可以稍微加0.5%FBS）培养箱内放置约3h至神经球贴壁不动8 S. T1 s7 ^, |% N; V- \2 L% c
4.免疫细胞化学步骤开始：弃培养基，PBS轻轻冲洗2次，加4%多聚甲醛（PFA）室温固定20min
# d6 E0 d$ e/ \+ M( y! n- q& I1 D5.弃PFA，用PBS 置换PFA，每次5min,3次" p3 W7 v( {) C4 M/ u- x
6.PBS加1%Triton X-100透化20min，PBST(PBS加0.05%Tween 20) 洗三次每次5min
. a1 H: e$ ], @: P; w, F6 }7.10%BSA （PBST配）室温封闭1h
0 N1 s  h0 g" b; K1 V8.1%BSA（PBST配）加一抗，室温2-3h或者4℃过夜
. k( W( `8 v' a$ Q, }; P9.弃一抗（可回收一次使用），PBST洗3次，每次5min' _" S1 C  c  X- Q/ M" `/ H
10.1%BSA（PBST配）加二抗，避光，室温2-3h或者4℃过夜
0 g- Z2 ~9 F- i! y, z/ v11.弃二抗（可回收一次使用），PBST洗1次，5min后PBS洗2次，每次5min，避光
7 _2 b. q% l$ p, |3 e, O12.1:5000-1:10000加DAPI染细胞核5min，避光，注意DAPI不溶于PBST0 T9 G. E: T: m! a: h9 g+ k
13.弃DAPI后PBS轻轻冲洗2次，培养皿内加适量覆盖培养皿的PBS后看荧光
4 o% [% C( c1 l7 _4 }8 a! e9 N
* W% o" Q; `7 X+ w: A7 h1 f5 O注意：1.整个过程，尤其PFA固定前不要距离晃动，避免神经球脱落。固定后即可在摇床上来回晃动/ o, U% X( j6 I& S  H2 z
      2.避免培养皿变干
; c$ c4 N" A- W2 J3 n      3.PBST，透化试剂最好新鲜配，试剂长毛会导致荧光看不到

jennyshy

这是我一直用的步骤

iseeyou1210

回复 jennyshy 的帖子
5 r0 H# v4 g# X4 c1 e
! S! B7 i) Z; A0 n: d( ^1 L& Y/ c8 phave you tried to section the neurosphere?

jennyshy

sure

xfyang2007123

回复 jennyshy 的帖子, z" o4 U9 M4 ~5 h
# Q! A0 i1 N& I6 b
感谢。