请教：神经球免疫组化protocol

smkx

哪位高手可以贡献下神经球免疫组化protocol参考下，非常感谢！

xfyang2007123

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; ^! ~, e" \5 U& t- x" O9 M* o$ P1 r' {6 }$ L) _+ _' v$ B
感谢。

jennyshy

sure

iseeyou1210

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$ ^: ]4 u9 I" P+ F' |: W5 L7 v3 M% x
have you tried to section the neurosphere?

jennyshy

这是我一直用的步骤

jennyshy

1.0.1mg/mL 多聚赖氨酸（PLL）包被培养皿 37℃ 至少3h(最多2d).
( o& \7 P7 i# ~$ k4 r2.弃PLL，晾干后PBS洗三次，晾干
/ @/ P5 H. n9 X3 ?3.种入神经球，完全培养基（若贴壁效果不好，可以稍微加0.5%FBS）培养箱内放置约3h至神经球贴壁不动
2 W. A2 C2 x, [7 ^2 T( A. I% _- {4.免疫细胞化学步骤开始：弃培养基，PBS轻轻冲洗2次，加4%多聚甲醛（PFA）室温固定20min& D3 b9 K4 {7 p" f
5.弃PFA，用PBS 置换PFA，每次5min,3次
/ X9 i' B4 L5 H. c4 z6.PBS加1%Triton X-100透化20min，PBST(PBS加0.05%Tween 20) 洗三次每次5min3 E' K, ~: @2 r3 V
7.10%BSA （PBST配）室温封闭1h
% B- b, T* n7 d; h8.1%BSA（PBST配）加一抗，室温2-3h或者4℃过夜
' H# T6 V8 Q: V$ X8 c9.弃一抗（可回收一次使用），PBST洗3次，每次5min+ K7 @2 |; |0 k1 e8 y
10.1%BSA（PBST配）加二抗，避光，室温2-3h或者4℃过夜, C  ?7 q$ ^3 F7 n! h4 [
11.弃二抗（可回收一次使用），PBST洗1次，5min后PBS洗2次，每次5min，避光
2 a$ P0 A. N2 q* R" g- |+ x) v+ |  A12.1:5000-1:10000加DAPI染细胞核5min，避光，注意DAPI不溶于PBST; N3 P# J. d) i- B) J: {% J
13.弃DAPI后PBS轻轻冲洗2次，培养皿内加适量覆盖培养皿的PBS后看荧光
& `7 k( f' m( Y% o* [" F9 i* `4 R4 S
注意：1.整个过程，尤其PFA固定前不要距离晃动，避免神经球脱落。固定后即可在摇床上来回晃动1 q* {7 c8 m. @- i3 c- G
      2.避免培养皿变干' b6 \9 M7 M7 z+ s  l/ T% J1 d9 W
      3.PBST，透化试剂最好新鲜配，试剂长毛会导致荧光看不到

xiaodiao123

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yuerenxi

有没有找到，我也想要这个东东呢