请教：神经球免疫组化protocol

smkx

哪位高手可以贡献下神经球免疫组化protocol参考下，非常感谢！

yuerenxi

有没有找到，我也想要这个东东呢

xiaodiao123

我也想知道

jennyshy

1.0.1mg/mL 多聚赖氨酸（PLL）包被培养皿 37℃ 至少3h(最多2d)., y3 T. ~# `4 e4 _! v* h8 k& F
2.弃PLL，晾干后PBS洗三次，晾干
! G7 W6 S4 o8 Y/ M/ s6 \) a3.种入神经球，完全培养基（若贴壁效果不好，可以稍微加0.5%FBS）培养箱内放置约3h至神经球贴壁不动, G' [% p: J0 K1 X
4.免疫细胞化学步骤开始：弃培养基，PBS轻轻冲洗2次，加4%多聚甲醛（PFA）室温固定20min3 e8 I4 r0 h- i: ]3 B# D; X# @
5.弃PFA，用PBS 置换PFA，每次5min,3次
  a* T/ k! Z3 w2 ^$ c6.PBS加1%Triton X-100透化20min，PBST(PBS加0.05%Tween 20) 洗三次每次5min! I; a* Z  l. E4 O8 ]$ P
7.10%BSA （PBST配）室温封闭1h2 y  ?* _2 a) u" F/ q2 S3 {; B
8.1%BSA（PBST配）加一抗，室温2-3h或者4℃过夜" r/ V) X! M9 t8 k5 L- j$ G) s8 c
9.弃一抗（可回收一次使用），PBST洗3次，每次5min
$ q1 k* M  ]3 D, }10.1%BSA（PBST配）加二抗，避光，室温2-3h或者4℃过夜
+ X4 Q% D5 S  T- A6 h1 n# U11.弃二抗（可回收一次使用），PBST洗1次，5min后PBS洗2次，每次5min，避光
3 E1 M& p8 W9 w9 Q; X1 U' g) L12.1:5000-1:10000加DAPI染细胞核5min，避光，注意DAPI不溶于PBST4 s$ |) h6 i, J" x+ ~' `  M
13.弃DAPI后PBS轻轻冲洗2次，培养皿内加适量覆盖培养皿的PBS后看荧光- ]! e% F: v. a
" W1 D* z( B/ R2 z1 b: G
注意：1.整个过程，尤其PFA固定前不要距离晃动，避免神经球脱落。固定后即可在摇床上来回晃动4 M! k$ s, m6 `6 r
      2.避免培养皿变干
: r# d" z5 q) R. d5 M* t! h. I1 F3 i& Q      3.PBST，透化试剂最好新鲜配，试剂长毛会导致荧光看不到

jennyshy

这是我一直用的步骤

iseeyou1210

回复 jennyshy 的帖子3 a! X( i2 c; ~- b. b/ g" C
+ A2 @3 e7 V# j  l' m5 L0 o5 b
have you tried to section the neurosphere?

jennyshy

sure

xfyang2007123

回复 jennyshy 的帖子
9 L6 B) x4 Y9 _4 w6 X5 C; t3 o& y. U. j* g7 j+ D: H' u9 b0 {
感谢。