请教：神经球免疫组化protocol

smkx

哪位高手可以贡献下神经球免疫组化protocol参考下，非常感谢！

yuerenxi

有没有找到，我也想要这个东东呢

xiaodiao123

我也想知道

jennyshy

1.0.1mg/mL 多聚赖氨酸（PLL）包被培养皿 37℃ 至少3h(最多2d).9 t3 `5 }* ^& \) I+ r
2.弃PLL，晾干后PBS洗三次，晾干
% F4 u. Z! s! R5 ^8 M3.种入神经球，完全培养基（若贴壁效果不好，可以稍微加0.5%FBS）培养箱内放置约3h至神经球贴壁不动
, T9 ^! `1 d! r/ w5 x4.免疫细胞化学步骤开始：弃培养基，PBS轻轻冲洗2次，加4%多聚甲醛（PFA）室温固定20min
8 m5 E' D' u' Z5 v5.弃PFA，用PBS 置换PFA，每次5min,3次
/ N1 G6 G  W& L6.PBS加1%Triton X-100透化20min，PBST(PBS加0.05%Tween 20) 洗三次每次5min
$ p$ v# f+ y' n" ~7 [. C7.10%BSA （PBST配）室温封闭1h* }0 [& t! r4 }4 m
8.1%BSA（PBST配）加一抗，室温2-3h或者4℃过夜0 b. ?7 ~9 |" q$ ?7 C3 L
9.弃一抗（可回收一次使用），PBST洗3次，每次5min/ `) T) w1 f4 ?; N9 Z' ~- x- l
10.1%BSA（PBST配）加二抗，避光，室温2-3h或者4℃过夜9 w, n3 K! _: l$ T; ?
11.弃二抗（可回收一次使用），PBST洗1次，5min后PBS洗2次，每次5min，避光
4 M) d" n3 H& y, l4 ~6 `3 |+ h12.1:5000-1:10000加DAPI染细胞核5min，避光，注意DAPI不溶于PBST# s8 U5 Y' Q& q3 D. C6 c7 i
13.弃DAPI后PBS轻轻冲洗2次，培养皿内加适量覆盖培养皿的PBS后看荧光
& O8 c; L: J+ b7 X2 r5 p
& v3 I  N) r. L; z注意：1.整个过程，尤其PFA固定前不要距离晃动，避免神经球脱落。固定后即可在摇床上来回晃动) ]" l. h8 P+ s8 F
      2.避免培养皿变干
% S7 A* K5 w, ^5 t  Q      3.PBST，透化试剂最好新鲜配，试剂长毛会导致荧光看不到

jennyshy

这是我一直用的步骤

iseeyou1210

回复 jennyshy 的帖子
9 ^' ^/ T1 S6 |4 v
' Y. s2 V1 g. W/ C2 P9 i; @have you tried to section the neurosphere?

jennyshy

sure

xfyang2007123

回复 jennyshy 的帖子! R% l1 g. Z+ r9 a) u3 @
: |! |) v6 N  ?4 l. {! W
感谢。