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1.0.1mg/mL 多聚赖氨酸(PLL)包被培养皿 37℃ 至少3h(最多2d)., y3 T. ~# `4 e4 _! v* h8 k& F
2.弃PLL,晾干后PBS洗三次,晾干
! G7 W6 S4 o8 Y/ M/ s6 \) a3.种入神经球,完全培养基(若贴壁效果不好,可以稍微加0.5%FBS)培养箱内放置约3h至神经球贴壁不动, G' [% p: J0 K1 X
4.免疫细胞化学步骤开始:弃培养基,PBS轻轻冲洗2次,加4%多聚甲醛(PFA)室温固定20min3 e8 I4 r0 h- i: ]3 B# D; X# @
5.弃PFA,用PBS 置换PFA,每次5min,3次
a* T/ k! Z3 w2 ^$ c6.PBS加1%Triton X-100透化20min,PBST(PBS加0.05%Tween 20) 洗三次每次5min! I; a* Z l. E4 O8 ]$ P
7.10%BSA (PBST配)室温封闭1h2 y ?* _2 a) u" F/ q2 S3 {; B
8.1%BSA(PBST配)加一抗,室温2-3h或者4℃过夜" r/ V) X! M9 t8 k5 L- j$ G) s8 c
9.弃一抗(可回收一次使用),PBST洗3次,每次5min
$ q1 k* M ]3 D, }10.1%BSA(PBST配)加二抗,避光,室温2-3h或者4℃过夜
+ X4 Q% D5 S T- A6 h1 n# U11.弃二抗(可回收一次使用),PBST洗1次,5min后PBS洗2次,每次5min,避光
3 E1 M& p8 W9 w9 Q; X1 U' g) L12.1:5000-1:10000加DAPI染细胞核5min,避光,注意DAPI不溶于PBST4 s$ |) h6 i, J" x+ ~' ` M
13.弃DAPI后PBS轻轻冲洗2次,培养皿内加适量覆盖培养皿的PBS后看荧光- ]! e% F: v. a
" W1 D* z( B/ R2 z1 b: G
注意:1.整个过程,尤其PFA固定前不要距离晃动,避免神经球脱落。固定后即可在摇床上来回晃动4 M! k$ s, m6 `6 r
2.避免培养皿变干
: r# d" z5 q) R. d5 M* t! h. I1 F3 i& Q 3.PBST,透化试剂最好新鲜配,试剂长毛会导致荧光看不到 |
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