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作者：陈舒怿作者单位：（200233）中国上海市，上海交通大学附属第六人民医院眼科 + J9 f; f! B7 k! ?% A! z
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【摘要】 探讨超顺磁性铁纳米颗粒（SPIO）标记对视网膜前体细胞体外培养的影响并对其进行量化,探求SPIO标记视网膜前体细胞的最佳浓度。方法：来源于19d胚胎大鼠的视网膜前体细胞，以不同浓度SPIO标记(Fe3 颗粒浓度为5.6，11.2，16.8，22.4mg/L)24～48h后，进行形态学观察和流式细胞技术、MTT和Turnel等技术分析，研究细胞增殖和凋亡情况。结果：当SPIO标记浓度低（22.4mg/L)时符合MRI示踪要求，但标记物对细胞产生毒性，影响其生长；浓度11.2～16.8mg/L时，既不影响细胞生长，也能达到较好的转染效率。结论：SPIO标记浓度在11.2～16.8mg/L范围内时为最佳，标记效率较高且不影响细胞的体外分化培养。 , W& l: i, c$ M) U0 t, Z
【关键词】超顺磁性铁纳米颗粒 视网膜 干细胞! n- E6 {( p8 |" \, _
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0引言6 Q2 g% X* x+ N2 r
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近年来，视网膜干细胞移植已经成为视神经变性和再生领域研究的热点之一，使以往认为无法治疗的理念得以更新[1]。但是，干细胞移植入体后，如何从受体辨别供体干细胞，并观察其在体内的迁移变化情况，一直是让人困扰的问题。MR示踪技术在解决细胞活体示踪的难题上是行之有效的，它有效成像时间长，可观察细胞的动态迁徙过程，且空间、时间分辨率高，对比度好[2]。超顺磁性铁纳米颗粒（SPIO）是近年来研究发现的新型磁共振阴性对比剂，可在活体标记神经干细胞[3]。Hoehn等[3]报道将SPIO标记神经干细胞移植入脑梗死模型大鼠脑内，用MRI可在活体上示踪移植到脑内的磁化标记神经干细胞。但是示踪剂的应用是否会对供体视网膜干细胞的分化生长产生影响呢？van den Bos等[4]发现，单纯使用SPIO标记细胞，使细胞内的自由基生成增加，会对细胞产生毒副作用。在该问题上，我们对示踪剂SPIO并转染剂，是否会对视网膜前体细胞体外分化产生影响展开研究，为SPIO 标记视网膜前体细胞体内移植的活体示踪提供前提条件。9 t6 B; C/ ]" t1 ]8 u" G
; a6 M2 B- S9 N |$ [- C 1材料和方法
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1.1材料 ( c3 ~+ D; ~7 o
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9 m) y" A0 G4 W 孕19d SD大鼠（由上海交通大学附属第六人民医院动物房提供，符合中国实验动物标准），取其胚胎视网膜作为实验材料。流式细胞仪：FACSCalibur美国becton Dickinson 公司；激光工作条件：氩离子激光器Class111b 美国光谱物理公司；计算机数据处理软件：Cellquest软件BD公司；CM120透射电镜：PHILIP公司；Aneexin VFITC/PI 凋亡试剂盒Biovision公司；Tunel凋亡试剂盒cat#1584809美国Roch公司；Ferumoxides[(Fe2O3) (FeO) ，商品名Endorem，Resovist，Fefidex]（SPIO）由上海交通大学纳米研究所赠送。
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1.2方法2 y' S' `$ @& f6 C$ ^( G- Q
3 z8 X0 H9 R% N8 I# r# A- c* _ 无菌条件下取出胚胎鼠完整眼球，Hanks缓冲液冲洗3次，去除多余的组织及视神经，沿巩膜缘剪开眼球，除去眼前节（虹膜、晶状体等）、巩膜、脉络膜等，保留视网膜。使用微量移液器尖端将其打碎后，于EDTA胰酶37℃ 消化5min。吹打并使用40μmol／L过滤器获取单细胞。低速离心（800r/min）5min，于新鲜培养液（含DMEM/F12，10g/L N2，20μg/L bFGF，20μg/L EGF）中培养。细胞隔天半量换液，3～5d以1∶2比例传代。细胞传一代后，即改为含10mg/L胎牛血清及Ferumoxides（浓度分别为0，5.6，11.2，16.8，22.4mg/L）的上述培养液中分组培养，24～48h后细胞经PBS漂洗一次，改为含10g/L胎牛血清、不含Fe3 颗粒的培养液培养，并取小部分细胞进行普鲁士蓝染色观察铁颗粒标记是否成功，推测转染效率。( Y, p8 Q; u( l4 i% F1 c8 J k
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1.2.1电镜观察
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分别收集对数期生长的各组细胞 1106个，经戊二醛固定、常规制备，LKBI型超薄切片机切片50～60nm，30g/L醋酸铀枸橼酸铅双染色，于CM120透射电镜观察细胞标记情况及凋亡形态。
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1.2.2凋亡检测! l6 P/ T& ~' V. T5 r" s
9 D$ ?2 e* l( [. ~9 X 把不同浓度标记的细胞分设定为A，B，C，D四组，无标记细胞为O组。取各组对数期生长的细胞，每组分别进行原位末端标记法（Tunel）、Annexin V/PI检测凋亡细胞，并运用流式细胞仪对细胞进行周期检测，以及MTT法检测细胞的生长活性。4 _4 H1 ~1 A5 n3 }6 w
8 `9 }( }3 x+ z4 @' ^" C- ~统计学处理：采用SPSS11.0软件进行统计学分析。; d; W: W* A W9 `( m0 }3 a' V
5 r; B. B0 M& p& U, y& @ 2结果, r Y/ R0 B5 [4 z2 Y1 R- M+ E
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取材得到的原代视网膜前体细胞24h贴壁，呈球状分布（图1A），传代后细胞成簇分布。SPIO标记成功的细胞，普鲁士蓝染色呈亮蓝色（图1B）。对各组细胞每组取10个高倍视野至少1000个细胞进行计数，计算阳性细胞占总细胞的百分数，结果显示当SPIO标记浓度在5.6mg/L时，标记率小于60%；而当浓度大于等于11.2mg/L时，标记率均在90%以上水平。
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2.1电镜检查结果0 O0 n; @" X) l0 v" p8 k
9 q4 T# u7 l3 Z$ W" _: @ 细胞经SPIO标记后，在细胞内形成含铁囊泡（图2A）。与未行SPIO标记的空白组（0mg/L）和低浓度SPIO标记组（5.6，11.2mg/L）比较，在SPIO高浓度标记细胞组（16.8，22.4mg/L）可观察到细胞的超微结构变化，如核固缩、细胞器溶解（图2B）等，表明SPIO标记在浓度小于16.8mg/L时并不影响视网膜前体细胞的生长。
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; `5 ~2 H4 h' q, H3 o. v 2.2 Tunel检测的结果
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细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞，表明有细胞凋亡。对各组视网膜前体细胞每组取10个高倍视野至少1000个细胞进行计数，计算阳性凋亡细胞占中细胞的百分数（表1）由此可见，在SPIO标记浓度大于11.2mg/L后，细胞凋亡数量明显增多。/ q* @4 e( b/ ^% {
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2.3流式细胞仪检测的结果
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流式细胞技术Annexin V分析结果显示，视网膜前体细胞在SPIO标记浓度16.8，22.4mg/L时，凋亡细胞明显增加，与对照组相比，有统计学差异（P& d& G! E6 o% g; b9 K M
$ Z5 K$ |- U8 | 2.4 MTT检测结果
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视网膜前体细胞在SPIO浓度为较低浓度时（5.6，11.2mg/L），生长曲线良好，其差别无统计学差异；而在浓度比较高（16.8，22.4mg/L）时，失去正常曲线，变为较低平，表明细胞在上述浓度SPIO标记后，细胞生长增殖受到影响(图3)。% \) E& l; a* }/ n/ O
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3讨论
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最近年来，研究者以健康的视网膜细胞或组织为供体，通过视网膜移植来尝试延缓宿主视网膜细胞的变性和替换坏死及凋亡的细胞，取得了很多成果。研究结果显示，成熟的供体细胞较难形成新的神经联系，采用胚胎全层视网膜或干细胞特别是视网膜干细胞和骨髓间充质干细胞作为供体成为目前研究的趋势[5 7]。视网膜移植属干细胞移植，入体后如何示踪成为摆在我们面前的大问题。目前，MRI技术已经被确定是移植示踪的好方法，他使干细胞的体内迁移能在活体得以动态观察。现已证明用MRI 活体示踪移植磁化标记神经干细胞在大鼠脑内迁移和分布是可行的[8]，能在活体上示踪移植到宿主脑内的磁化标记神经干细胞。
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2 [5 u* q4 u: E/ r; Y$ ESPIO示踪剂被认为是较有前景的示踪元素，Jendelova等[9]应用纳米氧化铁颗粒标记后细胞移植入大鼠脑皮质后，其低信号分布区50d后仍能在MR显示。它是一种颗粒物质，是一种新型的磁共振细胞内对比剂。它通过直接、受体或转染剂介导的包吞作用进入细胞。将示踪剂直接或其与转铁蛋白结合物放入培养基中和肝细胞共培养即可达到标记目的；SPIO也可通过静电作用与多聚左旋赖氨酸（PLL）或鱼精蛋白等转染剂结合，刺激干细胞内吞入胞内，达到较好的标记效率。Frank等[10]使用单纯SPIO颗粒和SPIO与转染试剂结合后标记干细胞，普鲁士蓝染色对照标记率，研究发现转染剂结合SPIO标记效率比单纯SPIO标记高100倍。标记时需兼顾标记效率和对细胞无损伤两个方面，SPIO的浓度对此有至关重要的影响：浓度过低无法达到较高的标记效率满足MR的需要。目前已明确单纯SPIO标记所需的高浓度会对细胞产生毒性[4]，但有人认为转染剂结合SPIO并无短期或长期毒性作用[11,12]，本实验结果证实：SPIO标记浓度过高仍会对细胞的生存能力、分化能力和凋亡率产生影响。把握好SPIO标记各种细胞的浓度要求，是移植细胞能否正常生长分化、MR示踪能否成功的前提。在视网膜前体细胞移植MR活体观察方面，SPIO标记的运用目前仍比较贫乏。SPIO标记视网膜前体细胞时，标记浓度较低（5.6mg/L），则标记效率较低，无法满足示踪的需要；标记浓度较高（16.8，22.4mg/L等），标记效率超过90%，但细胞出现凋亡，并随着标记浓度的上升而增多。在标记浓度为11.2mg/L左右时，既能达到较高的标记效率，又不影响视网膜前体细胞的体外生长增殖，与未标记细胞相比，其生存能力、分化能力和凋亡率都没有发生改变，故为标记视网膜前体细胞的理想浓度。视网膜移植是最热门的干细胞移植类型之一，随着科学技术的发展，SPIO标记在视网膜干细胞的移植示踪应用必将越来越广泛和重要。
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致谢：上海交通大学纳米研究所和东南大学分子影像学重点实验室。
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发表于 2009-3-3 12:27
发表于 2015-6-26 09:27
