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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2010-10-19 13:23 编辑
" S0 d. r4 a, C1 K, r( y5 q4 ` E% e) _$ D+ o8 R4 e
to sidalin301：
" r* E2 E) \% s" u' Y* Z/ C$ y! N1 j1 }5 B1 z& z, e) ^
你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。
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1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
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1 n# n1 S9 t- g0 `3 q! C& D 我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）
4 I2 j/ U" M2 B+ P, Z 不知道你的质粒具体是其中哪一个？6 H3 v6 G' B- v% A* ?5 K" C, u
1 ~$ `( A2 @, I: G" a% i9 c
! r6 c' |6 z* C4 Z9 [0 m" r 2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。9 h A2 Z5 e* C& h% I* {
希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。: O ^0 \3 \7 V# U* [# S/ s
6 R1 D, o' P( @0 y3 ^' D- N0 v
3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
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如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。
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7 V* k( _- x- t 具体的步骤是：; I+ x+ J: L2 A3 l, Y8 w( ] D! E
/ _3 y. m* j1 h# c9 I a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；
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d.然后分别回收你想要的片段进行连接。' D+ s( z; A$ { {: C7 U( e
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这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。9 @% l( q7 e7 W. T: M( d. {' [
1 F* C: T; T4 @: ^% y 这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。 |
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发表于 2010-10-19 10:15
