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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2010-10-19 13:23 编辑 ; {- s! b! u" g# l* o/ L
2 K* Z4 C. i0 i. hto sidalin301：+ q, @. A. A9 e0 G0 l2 }2 d2 ?. C3 ^2 D
' a9 p3 R/ T( a- J7 {" H( w
你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。
0 b& Y. F4 }2 g# D1 Y) `" t5 Y( N# o$ l4 `+ c/ W
1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
# K4 |# C$ ~$ i 1 g& B, X1 @8 a
我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）
: B7 f. E" Z( P: e7 V6 b8 [6 | 不知道你的质粒具体是其中哪一个？
$ e, |# s6 l+ m
/ C& Q$ W9 W1 x. F0 C& S4 p! z* ]
8 s8 Z1 s( p( m$ N& k+ f2 U
2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。
" ^; C% x% W& E, k* c$ w" B 希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。* b7 B4 b" w R" s/ H0 |0 ~
5 l. j! `2 l. A4 H# ?
3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。! H. O4 G& g% C) K7 U; U, X5 v( F
( `8 o( i. Z1 f9 a, ?8 q# W$ Y V
如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。8 \' [; _) S( L* q- n3 i$ z/ ~. ^7 K
5 a/ @2 j l5 @' _/ a 具体的步骤是：, v* ~( S& @2 x
, {/ ^" n6 D0 d. a8 }: c a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；
0 C6 H9 F0 Z5 L+ B8 U% b
- J% @( y$ l# ]) ~$ W d.然后分别回收你想要的片段进行连接。
2 L* t+ k2 y2 i1 ]0 L- t2 q
$ f+ z; t8 E6 z9 ? 这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。
' C! }6 Y3 G. d# y3 y7 R% z! A0 T3 @$ b! f# t1 _
这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。 |
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发表于 2010-10-19 10:15
