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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2010-10-19 13:23 编辑
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3 L' J$ ]$ @( S u3 Nto sidalin301：* r! a) q0 E* A$ K5 w# x3 n$ s4 K
7 V1 o1 z3 O. l% e7 ]3 ]1 r
你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。* M; O" r: f8 \1 N/ }5 I/ z! N
^ S' U, z' q5 o( I# ? 1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
) T: E g3 J0 x. i; C9 ^
/ o' c7 s* p" V" U& v' l 我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）3 i; @$ @% Y- o d5 t
不知道你的质粒具体是其中哪一个？ ~& |) Q) c% y. R2 e. o- t, u! d
3 T5 r- a2 K1 ]# u0 `
X! e. X; W' x/ {1 @- c
2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。: b( V% S) l/ d4 b
希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。
9 C& ^! @& {1 i2 Z+ k% D1 [. \5 J$ a
3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
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如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。' a. x' x# r, v
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具体的步骤是：7 }9 c$ j9 B5 w
5 o$ v A" a) i, t$ e1 ^( V$ @) n
a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；: q7 Q6 F$ k; a
" R) R) _6 \( F* V+ y# b d.然后分别回收你想要的片段进行连接。) l8 O# E W4 I+ a1 @7 q1 \8 ^
P! @+ [' Z8 B- c P 这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。+ G- _8 L8 B6 B: x. s4 z4 Q
7 V; U- \* N* }
这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。 |
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发表于 2010-10-19 10:15
