请教一个双酶切的问题

smiling

应该有影响。我觉得目的基因反向连接后不能表达出目的蛋白，有可能会表达出无序的没有意义的多肽（如果反向之后的序列上仍然有起始密码子ATG）。启动子应该是原有表达载体上的，不会因为你新加进去目的基因而改变方向。