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作者：杨怀中 王莉 廖国清 刘鹏辉 王红梅作者单位：内蒙古乌拉特前旗妇幼保健院，内蒙古 乌拉特 014400 + W2 ^/ D( l5 |' A7 s8 U" w
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【摘要】 目的 探讨实验性糖尿病大鼠骨髓促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子（SCF）在糖尿病红细胞形态功能改变中的作用。方法 链脲佐菌素（STZ）65 mg/kg一次性腹腔注射，72 h后测尾静脉血糖，血糖≥16.65 mmol/L视为糖尿病模型成功。用免疫组织化学方法检测骨髓组织中EPO的表达，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测骨髓上清及血清中SCF分泌水平的变化。结果 糖尿病组大鼠较正常对照组大鼠骨髓 EPO分泌水平增高（P＜0.05），骨髓上清及血清中SCF分泌水平两组比较无统计学差异。结论 糖尿病时EPO分泌水平增高，可能是机体的一种抗损伤反应； SCF分泌水平无明显变化。 ' v: U v4 t1 x, C5 E
【关键词】大鼠；糖尿病；促红细胞生成素；干细胞因子! ~7 a. S/ ^' l9 o2 P
近年来研究表明，糖尿病（DM）患者免疫功能低下以及微循环障碍等并发症的发生，与红细胞形态功能改变密切相关〔1，2〕，而促红细胞生成素(erythropoietin，EPO) 及干细胞因子（stem cell factor，SCF）是红细胞生长发育成熟过程中起重要作用的两种细胞生长因子〔3，4〕。目前国内外关于糖尿病红细胞方面的研究多集中在红细胞生理功能及变形能力的改变，EPO及SCF在糖尿病状态下骨髓中分泌水平如何变化尚无明确结论。本课题通过检测糖尿病大鼠骨髓中EPO及SCF分泌水平，旨在探讨糖尿病患者免疫功能低下以及微循环障碍等并发症的可能发病机制。
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1材料与方法* e' v+ v2 b/ @/ ?" x+ K, y
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1.1材料选用健康雄性Wistar大鼠（内蒙古大学实验动物研究中心提供）40只，清洁级，动物号为2002-0001，体重110～140 g，一月龄。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma公司），抗大鼠EPO抗体(Rabbit anti erythropoietin RSC7956)（TBD公司产品)，即用型SABC免疫组化染色试剂盒(SA1022 武汉博士德公司)，DAB显色试剂盒（20）(武汉博士德公司)，大鼠SCF ELISA试剂盒（Cat.No.3R151 美国RB公司）。
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1.2方法$ {. _& x. d( P+ Z F
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1.2.1实验动物模型的建立Wistar大鼠40只，随机选取20只，作为STZ致DM模型组；另外20只作为正常对照组。用0.1 mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=4.2），将STZ配成2%新鲜STZ溶液，滤菌器除菌，以65 mg/kg剂量一次性腹腔注射〔5〕。正常对照组用等量生理盐水腹腔注射。选择模型组注射STZ后72 h尾静脉取血测血糖，血糖≥16.65 mmol/L且尿量以及饮水量明显增多者列入糖尿病实验大鼠模型。实验期间动物统一笼养，喂以基础饲料，自由进水，不进行胰岛素注射治疗，每2 w测体重和血糖。
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- m3 h0 m+ I( @6 q6 s. k7 { 1.2.2标本的制备（1）饲养8 w后所有的大鼠称取体重，均禁食水10h，尾静脉取血测血糖；（2）取左侧股骨中上段骨髓组织固定于10%中性福尔马林溶液中，备作免疫组化用；（3） 取右侧股骨中上段骨髓用4℃0.9﹪生理盐水稀释10倍放入-70℃超低温冰箱备用；（4） 促凝管抽取静脉血1 500 r/min离心取其上清迅速放入-70℃超低温冰箱备用。- t1 I0 M% x1 b$ n
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1.2.3免疫组化方法采用免疫组化方法检测骨髓中EPO水平的变化，严格按照说明书操作，运用Image-ex自动数码图像分析系统对切片进行观察，每张切片随机选取2个视野，使用IPP5.1图像分析软件及Smartscape 2002生物显微图像分析软件测定其平均灰度值和阳性染色面积占整个视野面积的百分比。( R6 X, q* P* @5 s T
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1.2.4ELISA实验方法采用酶联免疫吸附测定法 (ELISA)检测骨髓上清及血清SCF水平。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，使用cvxpt32曲线分析软件绘制标准曲线，得出曲线方程。根据样品的OD值可用曲线方程计算出其浓度。
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3 \' c) N$ e; b" u$ h3 V 1.2.5统计学分析数据均以x±s表示，用SPSS11.5统计软件进行统计分析，两组数据间比较采用两独立样本ｔ检验，方差齐用ｔ检验，方差不齐用t′检验。
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2结果
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( a' v* v E9 ~, F 2.1一般指标糖尿病组大鼠较正常对照组大鼠明显消瘦，尿量显著增加，而且行动迟缓，饮水量增多，为正常对照组的2.5倍，毛发杂乱、色晦暗、无光泽，血糖值维持在＞16.65 mmol/L。正常对照组大鼠血糖值维持在正常水平（＜6.0 mmol/L）。
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3 G+ J! ^# X* z. O 2.2ELISA 检测SCF分泌水平的变化根据酶标仪测出样品的OD值，运用标准曲线所得方程计算出糖尿病组大鼠和对照组大鼠血清、骨髓上清SCF浓度值，两组间比较无显著性差异（均P＞0.05）（见表1）。8 s' e* v! N p
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表1两组大鼠血清、骨髓上清SCF值（pg/ml，x±s，n=20）的比较（略）$ G0 _0 \2 c8 t) w" w- c* |
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2.3免疫组织化学技术检测EPO分泌水平的变化EPO免疫组化结果：糖尿病大鼠骨髓组织出现强阳性反应，呈黄褐色，正常对照组大鼠骨髓组织出现弱阳性反应，呈浅黄色。运用Image-EX自动数码图像分析系统对切片进行观察，每个标本随机选取两张切片，每张切片随机选取2个视野，使用IPP5.1图像分析软件及Smartscape 2002生物显微图像分析软件测定其阳性染色面积占整个视野面积的百分比。其中糖尿病组阳性染色面积百分比（0.19±0.04）明显高于正常对照组（0.34±0.09），经统计学分析，两组间比较有显著性差异（t′，P＜0.05）。
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3讨论
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( `% h# }( ^" f 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO),也称红细胞生成刺激因子(ESF)，主要由浅表肾单位的肾小管周围毛细血管内皮细胞或成纤维细胞合成。EPO 促进红细胞生成的生物学效应是通过位于骨髓红系细胞表面的特异性EPO 受体（EPOR）介导完成。EPO 与EPOR 结合后，形成二聚体，再通过信号传导途径调节红系的增生和分化〔6〕； 红细胞集落生成单位细胞(CFU-E) 及中幼红细胞以前的各阶段幼稚红细胞的表面均有EPOR〔7〕。促使EPO分泌增加的原因很多，如贫血、血容量减少等，而红细胞损伤、携氧能力减低是EPO分泌增多的主要原因。本实验中糖尿病大鼠与正常对照组大鼠骨髓组织中均有EPO存在，但浓度不同，EPO免疫组化结果显示，糖尿病组大鼠骨髓组织出现强阳性反应，呈黄褐色，正常对照组大鼠骨髓组织出现弱阳性反应，呈浅黄色，可能与糖尿病导致红系细胞损伤有关； 红系细胞生长发育成熟受到阻碍，反馈性引起EPO分泌水平增高，具有修复损伤促进红细胞生长发育的作用，可能是一种保护性、抗损伤反应。 p' k" Z+ Q' g5 Y& C9 N
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" h9 ?* f2 Q" K1 L 干细胞因子(stem cell factor，SCF)是一种多能细胞因子，通过与c-kit受体的结合而促进造血干细胞和祖细胞的增殖、分化及其活性。SCF对造血有广泛刺激作用，其在红系分化中的一个重要功能是促进多能造血干细胞分化成为红系造血祖细胞并维持红系造血祖细胞的存活，使之能够顺利进入分化阶段〔8〕。有研究表明，当体内EPO分泌水平显著降低时，病人发生贫血，SCF在体内可能代替EPO诱导红细胞生成。 本实验采用ELISA方法测定SCF在两组大鼠骨髓与血清中的分泌水平，无明显差异；说明糖尿病骨髓红系细胞的损伤可能不能引起SCF分泌水平的变化，其分泌水平变化机理尚不明确，有待进一步探讨。
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