免疫荧光染色中的一些细节问题

小白

做石蜡切片的免疫荧光染色的时候，有一些细节问题，不知道怎样做效果比较好，大家发表一下意见。, w* j! \8 n" w
   1.枸橼酸缓冲液热修复，怎样避免脱片？（片子提前用多聚赖氨酸处理过）
  r4 O1 @! l0 a* B3 U4 A   2. 热修复的时候，片子和修复液一起从室温开始加热，还是等修复液到达95度以上再放入片子？
4 f0 x2 G0 I+ @+ R% I1 h8 G   3.加完一抗之后，需要室温孵育一会吗？还是直接4℃过夜就可以了？# n5 V5 ?* O4 B/ }' w4 D
   4.冲洗时，用PBS和PBST效果会有差别吗？用PBST背景色会明显降低？/ f% k" j$ h' l' m
   5.显微镜采图如果不能直接生成叠加效果，后期用Photoshop怎样调整叠加效果比较好，或者有什么其他好的叠加方法
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暂时这些问题，还有什么细节问题欢迎补充！

淡定

采用过微波修复和高压修复觉得高压修复效果好一点，不怎么脱片还很快，微波修复的话脱片多一些；关于放置顺序我一般是直接放进去一起加热；加一抗后可以37°孵育2小时也可以4度过夜，过夜时间一般是14-16个小时；我用的是PBS洗的，没有用过PBST；关于叠加用IPP也不错，不过最好还是在有专门处理图像软件的荧光照相机拍照。

深海寂寞鱼

to 小白：! B0 z. ]. l9 a5 Q) L3 C
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+ |0 A. X8 a2 O( {' g. l* x' d( e1. 枸橼酸缓冲液热修复，怎样避免脱片？（片子提前用多聚赖氨酸处理过）
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1 }% V0 h" m8 B$ G回复： 脱片是由多个原因引起的，其实大部分原因都发生在抗原修复步骤之前。: G7 m$ ]; H5 W
         主要的原因有：a. 组织本身的质量（例如，坏死、出血、炎性成分的多少），b. 组织的质地,  c. 组织固定的质量 （比如 固定的时间长短）,  d 载玻片处理的质量，e. 烤片时间的长短。
  D$ b  X" M) _" F6 I        在抗原修复这一步的话，我觉得尽量注意不要把切片在水里泡的时间过长（我身边有人在抗原修复之前，切片是泡在纯水或者自来水里）。
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* a" X: ?$ D& V2.热修复的时候，片子和修复液一起从室温开始加热，还是等修复液到达95度以上再放入片子？
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' w0 {0 d- o- P7 j回复： 如果是高压修复的话，待修复液沸腾后放入切片。 * F  m0 m( W* e& n
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3. 加完一抗之后，需要室温孵育一会吗？还是直接4℃过夜就可以了？
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回复：这个需要根据你实验的具体情况来调整。如果你需要降低背景、增加特异性，那么直接进入4度就可以。如果你需要提高阳性的可能，当然可以在室温放置一会。我们实验室基本上是根据室温来调整的，如果室温在25度左右的话，都是直接进4度孵育。如果室温只有16度左右，那么会在室温放置1小时，然后再放入4度孵育。5 a; g, L% }& o
     
6 y, c: V; W3 f' y/ S     这点上你不需要迷信任何人，要相信自己。如果刚开始做的话，我建议你还是以做出阳性结果为主，所以你可以尝试着先在室温下孵育1个小时，再放入4度孵育。
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4.冲洗时，用PBS和PBST效果会有差别吗？用PBST背景色会明显降低？
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# F/ k' B5 ~; _0 L$ o+ ?# c& ?3 u回复：会有差别，但差别不会像你想象的那么明显。PBST里的TWEEN会使背景有所降低，但同时也有可能会洗掉少许已经特异结合的抗体。; n5 p0 E+ F, }% r2 V8 r: j
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第5个问题，我没有什么经验。需要学习。请高手指教。