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作者：甘金莲 过七根作者单位：九江学院生命科学学院 江西九江 332000 ; h: U: P) T4 `* V8 l( y! y" N
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【关键词】神经干细胞 定向诱导 分化 应用/ e$ w6 e- n T& k8 v) t$ O
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神经干细胞的概念始于20世纪90年代，人们从成年个体脑区分离了能不断分裂增殖且具有多种分化潜能的细胞群后提出的。1992年，Reynolds等［１］从成年小鼠纹状体分离出能在体外不断分裂增殖并具有多种分化潜能的细胞群，首次提出了神经干细胞的概念，从而打破了多年来人们一直认为中枢神经细胞是在胚胎时期产生的，成年以后神经细胞的数目不再增加，只会因衰老而发生死亡的论断。1997年，McKay［２］正式提出NSCs的定义，认为神经干细胞是指具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，并能自我更新，足以提供大量脑组织细胞的细胞群。2000年，Gage［３］进一步概括NSCs的特性为：①可生成神经组织或来源于神经系统；②具有自我更新能力；③可通过对称或不对称细胞分裂产生新的细胞。7 E- f U. w; g) I$ B8 y8 i1 M3 m
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作为干细胞，神经干细胞具有以下特点：①自我更新的能力；②具有多种分化的潜能，能分化为本系大部分类型细胞的能力；③增殖分裂能力；④这种自我更新能力和多分化潜能可以维持相当长的时间，甚至终生；⑤对损伤和疾病具有反应能力。自我更新和多分化潜能是神经干细胞的两个基本属性。
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5 w/ t, c0 R% o0 ~% |. h [1神经干细胞的存在部位及来源% M6 w3 ]- f6 Z; _$ e$ L3 `$ y
5 z, j0 e' ?. ]" _& b神经干细胞不仅存在于发育中的哺乳动物的神经系统中，而且存在于包括人在内的所有哺乳动物的成熟的神经系统内。目前已证实胚胎脑和成年脑内均存在有自我更新和多种分化潜特性的神经干细胞［４］。Reynolds等［４］分别从胎鼠及成年鼠的脑组织中分离出了神经干细胞。近期的研究结果表明神经干细胞分布极其广泛，人们在胚胎或成年哺乳动物及人的近侧脑室的室管膜下层、室下区、纹状体、海马齿状回、隔区、小脑和脊髓等均已分离培养出神经干细胞。在啮齿类动物胚胎期的NSCs主要位于纹状体、大脑皮层、视网膜以及脊髓等部位，利用细胞培养技术目前已经成功地从上述部位分离出多潜能NSCs或神经前体细胞(Progenitor)。除了啮齿类动物外，人的胚胎组织也可以作为NSCs的来源。目前已经成功地从人的胚胎中分离和培养了神经干细胞，建立了人源性的可移植神经干细胞系。
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: E- N2 X/ B Z V6 h" }: i8 D2神经干细胞的定向诱导分化
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2 h7 K) F& Y, H0 _8 r4 @神经干细胞定向诱导分化是目前神经干细胞研究的重大课题。由于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞都可以用作特定细胞移植材料，所以如何充分利用神经干细胞多分化潜能，便成为研究的热点。据研究表明神经干细胞的分化与基因调控、细胞因子和外部微环境等密切相关。Pevny等［５］将神经元特异性的Sox2基因转染胚胎干细胞，再经维甲酸诱导，可获得90%以上的神经细胞。Giebel等［６］表达Nurrl基因对于中脑神经前体细胞分化为多巴胺能神经元起决定作用。这些研究表明基因调控与神经干细胞的定向分化密切相关。不同的细胞因子在神经干细胞的诱导分化中起重要作用，但尚没有一种细胞因子能在体外将神经干细胞全部诱导分化为所需的功能神经细胞，参与神经干细胞诱导分化的细胞因子有白细胞介素类，如IL-1、IL-7、IL-9及IL-11等。一些体外实验证实IL-1可以诱导神经前体细胞向多巴胺能神经元分化，分化率在25%左右。其它的白介素类有类似的作用。生长因子类，如上皮生长因子、神经生长因子及碱性成纤维细胞生长因子等，目前的资料表明，当把EGF注入成年大鼠或小鼠脑室系统内后，室周区(SVZ)内的细增殖明显增加，粒下层(SGZ)神经胶质细胞分化成熟的比例增加，而成熟神经元的比例则下降［７］。当把bFGF 注射到新生小鼠体内后，发现其脑内新生神经元的数量增加［８］，而在成鼠体内这种作用则不明显。如果将培养的神经干细胞置于脑源性神经营养因子作用下，大量的神经干细胞可以表现出分化神经元的特性。神经干细胞的分化还与外部微环境有关，Han等［９］观察到神经元限制分化性的前体细胞在成体脊髓内仅分化为神经元而非胶质细胞，说明成体的中枢神经系统内非神经再生环境不影响神经前体细胞的分化行为。Nishino等［１０］将取自鼠E12中脑的前体细胞，移植至偏侧帕金森病模型的双侧纹状体区，发现病变侧较健侧脑组织内神经前体细胞更易分化为TH 神经元，说明多巴胺（DA）耗竭的纹状体区提供了更利于中脑于细胞分化为成熟DA能神经元的外环境。Yang等［１１］的结果与之相符且发现移植的前体细胞还能与周围神经细胞建立起恰当的功能联系。
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3神经干细胞的研究方法 ( F3 K" ^+ y% Y) S6 g( P- @2 r
/ Q" k7 }: B8 W, d* P3 S3.1 在体研究利用逆转录病毒或T(thymidine) ,BrdU( bromodeoxyuridine)可对处于分裂状态的细胞进行标记的特性，研究者对存在于体内的神经干细胞群进行了大量的研究，现已基本达成共识，在所有成年哺乳动物的大脑中至少有两处，即海马齿状回和SVZ区仍保有高密度的细胞分裂，而且这种能力在整个生命期间均可保持。分裂后的细胞一部分仍维持干细胞特性，另一部分则发生迁移并最终分化为神经元或胶质细胞。有些研究者则认为［１２］，成体中枢虽保留了一些有分化潜能的干细胞，但它们通常处于“静止”状态，只有在某些因素作用下或者受到损伤刺激时才被激活，重新进入细胞增殖周期，并进一步分化为特定功能的神经细胞。体内干细胞的功能状态受很多因素影响,如学习因子、年龄糖皮质激素、谷氨酸能系统、生长因子等［１３］。9 R' E- r$ D" q' x
; n4 w, ?' y8 O' x9 b" F3.2 体外研究体外研究的基本方法是在活体动物脑内已经确定有细胞分裂的部位（纹状体、海马、室下区、室管膜下区等）切取部分组织，置于含有高浓度的丝裂原的培养基中培养，经过增殖后，对其子代细胞的特异性抗原进行检测。有关特异性抗原，Lendahl等［１４］首先发现NSCs或前体细胞表达一种中间丝蛋白（intermediate filament），并将其命名为巢蛋白（nestin），该蛋白只在多潜能的神经外胚层细胞表达，随着神经上皮的分化成熟逐渐消失，其功能现在尚未完全明确，可能具有结构和信息传递的功能。通过检测巢蛋白的表达以确定多潜能干细胞的存在是目前普遍采用的方法。对于分化的鉴定是通过在单细胞形成子代克隆中，应用免疫细胞化学染色方法检测神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞所表达的特异性抗原。目前国外一些研究机构通过逆转录病毒或癌基因修饰建立了永生化干细胞系，它为我们提供了更为高效的方法。值得注意的是，经过修饰的“永生化细胞”的遗传特性并不稳定，可能在分析正常基因对子代细胞分化方向时产生影响或在移植后生成肿瘤，因而其应用价值有待于进一步评价。 R' u1 s U# x$ R; X5 p0 f
; y) ~) @) g6 e. f+ d4神经干细胞的研究意义及应用
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神经干细胞的发现，给中枢神经系统损伤和其他大脑退行性疾病的治疗带来了希望。NSCs作为一种全新的生物学治疗方法，随着分离培养、体外扩增等技术的日臻完善，神经于细胞的研究已逐渐从实验室走向临床应用，其应用主要集中以下几方面：一是直接细胞移植进行替代治疗，神经干细胞作为细胞移植的来源，可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活，分化为神经元和胶质细胞，与已经存在的细胞结构整合到一起；二是以NSCs作为基因载体，携带治疗作用的报告基因进行移植，从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用；三是通过对生长因子和细胞因子的研究，诱导自身的NSCs分化进行神经自我修复。; `* R, o; m1 G9 Q$ x% t3 w
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5问题与展望
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对NSCs的基础研究和应用研究才刚刚开始，还有大量的问题尚未明确。如成年中枢神经系统中干细胞的作用、功能和位置；在体内观察到的干细胞与在体外分离的干细胞是否同种细胞；神经干细胞特定功能状态的调控机理；体外操作对于细胞分化特性的影响；干细胞定向分化的诱导因子以及它们作用的机制和神经干细胞的来源；神经干细胞诱导、分化及迁移机制；定向分化诱导在NSCs应用于临床的一个关键问题等等都有待进一步研究。7 H' m7 Z) x5 ]5 V/ Y( e
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NSCs的替代疗法和基因治疗已经显示出了很好的发展前途，可以看到NSCs的发现及其应用研究无论在理论上还是实践上都具有重大意义。但是干细胞技术从基础实验到临床治疗应用还有待于付出更大的努力。虽然神经干细胞研究还处于起步阶段,但已在医学领域中呈现出诱人的光辉前景,其临床应用具有巨大的潜力,为目前一些难以根治的神经系统疾病带来新的希望。我们相信终有一天随着上述问题的解决,它在神经系统治疗方面乃至整个生命医学上的价值将得到体现。干细胞的诱人应用前景将吸引科学家进行更深入广泛的研究，这必将对人类生物学产生巨大而深远的影响，人类将在现有的基础上更加认识自我发展并完善自我。3 M0 n( D- P( |1 ^) a" j9 v& p2 X
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