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发表于 2009-3-3 12:28 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：尹海燕  吴巧凤  曾芳  魏焦禄  乔秀兰  卢圣锋  余曙光  唐勇作者单位：成都中医药大学针灸推拿学院，四川  成都  610075
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      【摘要】  目的  比较老年学习记忆减退大鼠接受艾灸治疗后海马干细胞相关基因的变化，寻找与艾灸有关的海马干细胞相关的基因靶点。方法  将经行为学筛选后的老年SD大鼠随机分为对照组、模型组和艾灸组。选用“百会”、“命门”穴位艾灸治疗，每次10 min，每日1次，10次为1疗程，6个疗程后取海马组织以干细胞基因芯片筛选与艾灸有关的干细胞相关基因。结果  在258条基因位点中，模型组与正常组比较，17条基因表达上调，36条基因表达下调；艾灸组与模型组比较，40条基因表达上调，43条基因表达下调。结论  艾灸对老年学习记忆减退大鼠海马干细胞相关基因的影响是多方面的，重点靶点可能主要在于Fgf、Tgf、Wnt和Sox家族。
      【关键词】海马；干细胞基因芯片；艾灸疗法
   基金项目：中国博士后科学基金（No.2005037801），国家自然科学基金重大研究计划（90709032）( Y1 f+ S5 `( E: z4 ]# D! o
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　　The effect of moxibustion on hippocampus stem cell related genes in aged cognitive decline rats* b% D- l9 x+ @+ x

　　YIN HaiYan, WU QiaoFeng, ZENG Fang, et al.+ q: B- ^" o- `! [+ J' y& ?
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　　Acupuncture and Manipulation College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan, China

　　【Abstract】ObjectiveTo detect related gene changes of hippocampus stem cells in aged cognitive decline rats treated by moxibustion and to screen the stem cells gene targets. MethodsThe aged SD rats screened by ethology were randomly divided into control, model and moxibustion (Baihui, life cate moxibustion, 10 min every time, once a day, 10 times as a course of treatment) groups. The stem cell biochip was used to seek for the changed stem cell related genes in hippocampus after 6 courses of treatment.ResultsOf 258 gene locuses, there were 17 upregulating genes and 36 downregulating genes in model group comapring to those in control group; 40 upregulating genes and 43 downregulating genes in moxibustion group comparing to those in model group. ConclusionsThe moxibustion therapy can regulate many kinds of genes expression in learning and memory defict aged rats hippocampus, especially Fgf, Tgf, Wnt and Sox family. # D( B2 {2 Z: N

　　【Key words】Hippocampus; Stem cell biochip; Moxibustion therapy

　　研究表明，学习记忆能力的提高与海马干细胞相关基因的激活密切相关〔1，2〕。在发现艾灸疗法能提高学习记忆能力的基础上〔3〕，运用高通量干细胞基因芯片技术对老年学习记忆减退大鼠接受艾灸治疗后的海马组织与干细胞相关基因进行筛选，是寻找相关基因靶点进行艾灸防治老年学习记忆减退现代科学机制研究的重要环节。) \  _& M/ V) L' S) @
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　　1材料与方法
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　　1.1动物选择及分组老年雄性SD大鼠60只（清洁级，24月龄，体重450～500 g），SD青年大鼠10只（清洁级，4～5月龄，体重150～200 g）。所有动物由四川省医学科学院实验动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK（川）200511。动物房温度和湿度分别维持在20℃和70%左右，光照/LD＝12/12，动物自由饮水摄食。适应性喂养1 w后，所有大鼠接受Morris水迷宫行为学测试，每天训练4次，连续6 d后取平均逃避潜伏期大于青年大鼠平均逃避潜伏期x±2 s的大鼠为老年学习记忆减退大鼠，在x±2 s以内的为正常老年大鼠。按照上述标准共筛选出符合标准的老年学习记忆减退大鼠30只，随后再随机分为正常老年对照组（简称对照组）、老年学习记忆减退组（简称模型组）和老年学习记忆减退＋艾灸组（简称艾灸组），每组各10只。1 p; p/ k& o+ ?0 O/ k

　　1.2动物处理及取材选取督脉“百会”、“命门”穴，大鼠固定器固定后，剪去穴位区皮毛，操作者持艾条距离穴位1～1.5 cm处施温和灸，每次10 min，每日1次，10次为1疗程，共治疗6个疗程，各疗程之间均休息2 d。对照组和模型组除不予艾灸治疗外，以同样方式给予相同时间固定。
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　　1.3基因芯片检测基因芯片为干细胞基因芯片（美国Super Array公司产品，型号：MM601.2，由上海康成生物工程有限公司提供），共计258条基因。具体检测步骤:①RNA提取：每个样本取50 mg海马组织加Trizol裂解后匀浆，加氯仿抽提1次，转移水相加异丙醇抽提，离心沉淀RNA，75%乙醇洗涤，空气中干燥沉淀5 min。加入无RNA酶的水溶解，紫外分光光度计定量检测及琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA质量。②探针合成：加10 μl预热的RT混合液到10 μl退火混合液中，混匀后42℃孵育90 min，经反应得到cDNA探针。③芯片杂交：60℃预杂交1.5 h后，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60℃杂交过夜，洗膜2次。④芯片扫描及数据采集：芯片杂交洗膜后，用化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit (SuperArray Bioscience，Catalog Number D01)进行发光标记，经X射线胶片曝光后，将胶片上的图像用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据。⑤数据分析：用GEArray Analyzer软件对原始数据进行去背景计算以及比较运算。原始数据将首先被减掉背景最小值，继而用管家基因来进行校正，校正后的数据用来进行样品间基因转录的相对丰度分析。以大于2，小于0.5分别确定为上调、下调基因。通过两两列表比较寻找出上调、下调基因，然后将其汇聚寻找到都有显著变化的基因。
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　　2结果
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　　2.1RNA质量检测结果提取的总RNA OD260／OD280值在1.8～2.1之间，均符合要求。采用凝胶电泳图谱分析有清晰的28s和18s条带（图1），表明提取到所需高纯度RNA。
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　　A对照组；B模型组；C艾灸组# e5 D0 k/ i+ y3 b
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　　图1提取的RNA的凝胶电泳图（略）

　　2.2基因芯片筛选结果9 H9 @$ P  d. D
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　　2.2.1模型组与对照组大鼠海马基因表达水平比较见表1、表2。7 a0 U. Q* N0 E0 N( i/ `" G; m: c' c
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　　2.2.2艾灸组与模型组大鼠海马基因表达水平比较见表3、表4。

　　表1模型组与对照组大鼠比较上调2倍基因表达列表（略）

　　干细胞基因芯片主要分为干细胞和分化细胞分子标记、生长因子和细胞因子、细胞外基质分子和其他4大类。表1～表4显示，在模型组下调的36条基因中，归于干细胞和分化细胞分子标记10条：Col6a2，Fabp7，Gcm2，Gfap，Gja7，Il6st，Ina，Pax6，Ntf3，Prox1；生长因子和细胞因子20条：Cntfr，Dlk1，Fgf1，Fgf6，Fgf10，Fzd3，Fzd4，Fzd7，Igf2，Igf2r，lgfbp3，Il6,Il6ra，Inhba，Ptch，Ptch2，Tgfb3，Tgfbr1，Wnt6，Wnt7b；细胞外基质分子4条：Cst3，Itgal，Itgav，Itgam；其他2条：Sox17，Sox18。艾灸组上调的基因与模型组下调的基因对照，除了Fgf1、Gcm2、Igf2，Igf2r，lgfbp3,Ntf3没有上调外，其余30条均能产生上调作用。另外，艾灸组还能上调未在模型组表现出下调现象的10条基因。它们分别是归于干细胞和分化细胞分子标记的Krt28、Olig2、Prom；归于生长因子和细胞因子的Tgfb1，Tgfb2，Tgfbr2、Wnt5b，Wnt8a和归于其他类的Sox13，Sox15。

　　表2模型组与对照组比较下调2倍基因表达列表（略）4 D/ e. q) G+ p/ H5 z8 s
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　　表3艾灸组与模型组比较上调2倍基因表达列表（略）

　　表4艾灸组与模型组比较下调2倍基因表达列表（略）! [# C* ^8 P( H( T( ^0 ]

　　在模型组上调的17条基因中，归于干细胞和分化细胞分子标记7条：Pdgfra，Ptprc，Scgn10，Sox2，Tubb3，Zfp110，Thy1；生长因子和细胞因子5条：Notch1，Pdgfa，Pdgfb，Pdgfrb，Tgfbr3；细胞外基质分子1条：Tnc；其他4条：PTEN，Sox3，Sox5，Sox6。然而，艾灸组下调的基因与模型组上调的17条基因比较，仅有5条（Notch1、Pdgfrb、Scgn10、Sox5、Sox6）表现出了下调。除这5条外，艾灸组下调的不属于模型组上调范围的另外38条基因分别是：12条归于干细胞和分化细胞分子标记的Fzd9，Gata2，Gata4，Gjb3，Gjb5，Isl1，Mtap1b，Myh11，Myhca，Ncam1，Pdx1，Slc1a6；11条归于生长因子和细胞因子的Bmp5，Fgf11，Fgf12，Fgf14，Fgf7，Fgf8，Fgf9，Notch2，Notch3，Insrr，Nrg1；10条归于细胞外基质分子的Cdh2，Icam1，Itga2，Itga2b，Itgb2，Itgb3，Itgb4，Itgb5，Itgb6，Pecam；5条归于其他类的Dnmt1，Dnmt2，Dnmt3a，Sox4，Sox9。! ?) p1 O, \4 I4 r
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　　3讨论

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　　干细胞基因芯片可用于研究干细胞识别、生长和分化的基因的表达。本研究使用的芯片由美国国家老年研究所干细胞生物学中心的Luo博士和Rao博士共同开发，上海康成生物工程有限公司提供。该芯片包含了编码各分化阶段干细胞标志物的基因91条；调控干细胞生长的生长因子和细胞因子基因99条；细胞外基质分子基因38条及其他蛋白基因（如与干细胞分化有关的细胞周期调控基因等）30条。
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　　运用该芯片一次性得到了大量与干细胞相关的基因表达变化数据，通过模型组显著下调的基因和艾灸组显著上调的基因变化比较分析后发现，在模型组下调者，艾灸大部分能上调，这提示艾灸能促进下调基因的上调表达，从而有利于从疾病状态向生理状态恢复。虽然Fgf1、Gcm2、Igf2，Igf2r，lgfbp3,Ntf3在模型组表现的是下调，但艾灸组却没有呈现显著变化，这也可以从另外一个角度解释，机体是一极其复杂的系统，与干细胞相关的基因也是种类繁多，而艾灸作为一种刺激方法，也必定不可能是万能的，也会是有所为，有所不为。这6条基因没有显著变化的现象可能提示，它们不是艾灸作用的主要靶点，或者也有可能是艾灸的方法、疗程等刺激参数的强度和幅度等没有达到引起它们上调的阈值。同时，结合艾灸上调的另外10条基因（Krt28、Olig2、Prom、Tgfb1、Tgfb2、Tgfbr2、Wnt5b，Wnt8a、Sox13、Sox15）来分析，艾灸后可能主要影响的是Tgf、Wnt和Sox家族。因为生长因子和细胞因子类的Tgf家族中包括了Tgfb3、Tgfbr1、Tgfb1、Tgfb2和Tgfbr2的一致性上调；Wnt家族中包括了Wnt6、Wnt7b、Wnt5b和Wnt8a的一致性上调；其他类的Sox家族包括了Sox17、Sox18、Sox13和Sox15的一致性上调。+ D' Z# ^+ f) H9 A9 r; C
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　　再进一步分析比较模型组显著上调的基因和艾灸组显著下调的基因情况发现，在模型组上调的基因涉及17条，但艾灸组仅有其中5条下调，综合模型组36条基因下调而艾灸组上调其中30条的情况，是否可以提示艾灸在上下调节作用方向上重在促使下调基因的上调表达；在艾灸下调的基因家族中，Fgf家族中Fgf11、Fgf12、Fgf14、Fgf7、Fgf8、Fgf9均呈现一致性下调，综合该家族的Fgf6、Fgf10在艾灸组上调的结果，可以提示,艾灸对Fgf家族中的不同亚群影响不一，也许这正是艾灸能通过调节Fgf家族相关基因的平衡从而发挥作用；另外，Sox家族的Sox5、Sox6、Sox4、Sox9均呈现一致性下调，结合Sox17、Sox18、Sox13和Sox15的上调结果，可初步认为，艾灸对Sox家族的影响也可能呈现平衡调节作用。

　　综合本次实验结果，初步可将下一步深入研究艾灸对老年学习记忆减退大鼠海马干细胞相关基因的影响重点放在Tgf、Wnt、Fgf和Sox家族。当然，也有可能在本实验中有显著上调、下调的其他基因会是艾灸作用的真正靶点，这些都有待于下一阶段结合敲入（Knock in）和敲除（Knock out）或敲减（Knock down）等分子生物学、基因功能研究工具和手段进行研究证实。
      【参考文献】
　　1  Hisatsune T，Tozuka Y，Fukuda S.Adult hippocampal neurogenesis〔J〕.Tanpakushitsu Kakusan Koso,2006;51(3):24955.

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　　2  Lie DC，Song HJ，Sophia AC，et al.Neurogenesis in the adult brain：new strategies for central nervous system diseases〔J〕. Annu Rev Pharmacol Toxicol,2004;44:399421.  D: H) q9 u, {/ _1 g* n
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　　3  王中林，陶  勇，徐恒泽，等.艾灸、电针、穴位注射对小鼠衰老模型空间分辨学习能力的影响〔J〕.南京中医药大学学报,1999；15(5):3045.

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