请教做RT和Western需要用多少细胞

zhaoyan1983

如题！做RT或是Western大概要准备多少细胞才够？需要的量多不？

wujian

我们的经验，看你做的指标了和你的细胞。一般的指标RT12孔板养的细胞就足够了。wb要多一些，我们一般用6孔板养的细胞。但要是内参或者是很好处的东东，那少一些也无妨。

zhaoyan1983

回复 2# wujian 9 ?+ \5 z; Y7 U! ?; O$ N

8 z7 J8 [" v: {- H4 c& {
1 c+ k  F- I8 z2 m' M- [/ Z) u/ }    RT需要这么多的细胞啊！另外请教一下，Western（要定量）在做之前不是要计数么，但是不可能细胞计的那么准的，理论上差多少是允许的？9 l4 Y; S/ J2 H$ Q1 G

1 l4 h- V, w  o8 @' w2 h2 ]   我要用某诱导剂分别在不同时间段对蛋白表达量进行测定，有没有更准确一点的方法，总觉得Western要定量的话 数据不是太准
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8 z8 s7 p/ w3 {9 h! D- A    还有一个问题，一次Western可不可以用来测两种蛋白啊，就是同时加不用的抗体在一次反应中检测多个蛋白含量，可以这样做吗

wujian

通常我们做WB都是最后用内参办定量的。不同大小的蛋白可以一次跑胶，切开，分别孵育一抗。至于两个抗体一起孵育，我没做过。

luoziwei

可以先把两个蛋白切开分离开用一抗孵育，但也可以同时用两个抗体孵育，但这样的话中间就多了一个洗涤的步骤，这样会使条带变暗。而且这样做的不确定因素复杂，不建议这样做，除非你是做WB的行家了。

luoziwei

一般的RT需要的细胞量不大，主要是你提的RNA纯度够，用bioteke的试剂盒就够做好几次PCR.做WB的话细胞要求量较大，我们都是把6孔板的两个孔收集一个样，如果蛋白浓度还低，就先离心一次，弃上清，再离心收集。简而言之，就是浓缩提取。

贝西高原1

谢谢分享

xiaoma402716390

RT需要细胞不多，100ml的培养瓶长满就够了。wb做之前要计数

zhaoyan1983

RT需要细胞不多，100ml的培养瓶长满就够了。wb做之前要计数3 E5 @5 w2 c  h$ ]/ g
xiaoma402716390 发表于 2010-10-26 00:44

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/ e$ ^. F0 S7 d8 t    这还叫不多 ？不至于用这么多吧 ！貌似wb也用不了这些吧

dongleizhang

rt的话，10的6次方好像就够了，我们一般用周血0.5ml提取的单个核就足够做了