培养细胞观察与检测方法

若兰汀

0 U5 P( J( }7 z$ S; ~2 J

2 t- j  B) \" \! r3 w& w细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。
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　　第一节 培养细胞的常规检查和观察方法
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　　细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为：7 x/ W- K* V2 _5 f4 W8 }  p$ q
　　一、肉眼观察
8 P  M5 H' q/ z+ u4 }7 m　　一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。
, }% D- t- D3 a) P　　二、显微镜观察( U& y7 r( y  P7 ]0 O
　　生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。8 z  Z7 t7 J/ {  w. a; r* y
　　三、细胞的生长状态
. [0 u5 g" \7 B; J% l9 L5 {9 C　　细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。  I1 A4 b  h) u4 m8 P; g$ Y
　　四、微生物污染
+ Y0 N- J; ^9 z) a( S1 n, ^. i　　细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。
5 k) \& L" h  d) O　　; H9 k) l1 c8 N5 Y7 U6 p
　　第二节 培养活细胞的观察方法
1 p) y/ H2 x: d/ u+ Z  C　　
% J- v0 }4 r# B4 j' b3 Z  j0 a　　培养活细胞可用相差显微镜直接观察，也可用缩时摄影直接记录活细胞的动态变化，还可将离体活细胞染色。
! F' w6 p- a+ o: |' n/ q  D　　一、相差显微镜直接观察法$ o8 D( d6 i6 q5 T5 w
　　活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。为了观察活细胞的结构，则需要通过其他途径提高结构的反差。本世纪30年代，荷兰物理学家Zernike设计的相差显微镜(Phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而成功地解决了生物学上的大难题。
% {1 U& E$ S! G" D　　相差显微镜由相差聚光器和相差接物镜两个主要部分组成。它与普通光镜相比多了两个部件，一个是在聚光器上增加一个环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥、聚焦到标本上。另一个是在物镜的后焦面增加一个相板，相板有一个环形区，其大小恰好通过环形光阑束的直射光，相板各区镀以不同物质，使得通过环形区的光比通过相板其他部位的光超前或滞后1/4λ。- R+ U) I) f; a, O# x: i
　　相差显微镜的基本原理是：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰可见。光线透过标本后，发生折射，偏离了未通过标本的光线的光路，这两组光线合轴后，则发生相互干涉现象。透过生物标本发生折射的光线与未透过标本的光线之间产生了光程差。前者被阻滞了1/4λ(波长)。如果把光程差再增加1/4λ，则变为1/2λ，合轴后两束光线的干涉加强，使标本周围发生晕圈，提高了可见度。
+ b* A( N0 D7 z: y" j$ Q　　用相差显微镜观察活细胞，并可在镜下连续拍摄记录体外培养细胞的活动，如细胞分裂、细胞迁移运动等过程。相差显微镜观察活细胞的步骤如下：
2 `# G( w' `8 _4 u' ^7 A　　1、调整好相差显微镜
5 d# b9 K* H/ P　　首先调好相位板，使聚光器相位板号与接物镜放大倍数(相位板)相一致。然后抽出接目镜，再换辅助望远镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视影中两个大小一样的光环相互吻合。再重新换上原接目镜，即成相差图像。当更换不同倍数接物镜时，需按上述过程重新调节。5 C2 G9 N" J( C+ W; b# y
　　2、观察瓶皿准备
0 G7 ~% s+ {: j: k% f6 [4 _3 `　　准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净，勿留任何残留污迹。/ N1 ?) a1 ~! H2 k
　　3、调光0 i! ^3 j% K+ r. q" Z3 m) F
　　主要调整照明光的照明度和光轴，令视野照明均匀。首先用低倍镜，并把照明灯虹彩光调至最小，使光落于视野中央；如有偏斜可用聚光器的调整螺丝进行调整。然后打开虹彩使视野内呈均匀照明强度，并使目的物图像达到最大限度反差为止。
+ A2 N2 z/ F  O5 I　　4、调焦与摄影
% z- j% N+ V0 B" |; T　　较高级的相差显微镜视野中间都有双线十字，调焦前先转动目镜使十字的双线清晰，然后再用调焦旋扭调节物镜，使观察物体清晰。在照相目镜上也要采用同样步骤调焦。摄影目镜与观察目镜焦点不一致时，也要根据需要调焦，一般照相时以摄影目镜为主，观察时以观察目镜为主。
- P9 x, }, b" h* n- j& h　　照相时应做好记录，把细胞种类、代数、观察内容、放大倍数、时间等一一记录下来，以备后查和对比。- V1 S* C* l6 d, i
　　5、细胞观察
6 @0 u7 O, z' B1 o　　生长在瓶底上的细胞最适宜用倒置光相差显微镜观察，而且需附有长焦距集光器，才能观察厚度较大的培养瓶（或皿）。若用油浸镜观察细胞微细结构，需用支持物培养法，把细胞培养在长形盖片上，观察时从瓶中取出制成临时标本。方法为：取一大型载物片，再取一块优质滤纸剪成长方窗形，置于载物片上，用吸管向纸框中滴数滴培养液，使充满框内空间和浸湿纸框；把生长有细胞的盖片含细胞面向上放在纸框中，再覆以大盖片。观察时应不断从标本测面滴加适量营养液，以防不断蒸发。此法只限于短时间观察细胞之用。
% S6 R7 r- g, W9 H& ~  [' F5 c　　用相差显微镜观察细胞应注意瓶（或皿）的厚度、均匀性、清洁度、气温等。经标准化生产的培养板、培养瓶（或皿）一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。天气较冷时，若与显微镜观察处温差较大，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，此时可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。若对原代细胞培养进行相差显微照相，最好选择换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈振荡。观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。  T8 N  f( ?3 u* Z
　　二、暗视野显微镜技术观察活细胞
! w8 `! G6 E" l4 M' h/ P- f  `) d　　暗视野显微镜(dark field microscope)是利用特殊的聚光器，使照明光线斜射不能进入物镜，所以视野是暗的，只有经过标本散射的光线才能进入物镜被放大，在黑暗的背景中呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，甚至可以观察到5nm的微小质点。这种观察方法主要观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，只适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。所以这种方法已较少应用。4 m2 K! c+ e2 s* [- F2 t
　　三、缩时显微摄影观察& H: z5 E" J0 G9 M
　　这是随着现代科技发展而出现的一种新的观察方法。缩时显微摄影术（time-Lapse Cinemicrophotagraphy,TLCM）可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。如接上显微镜闭路电视系统或接上观察细胞变化的定格电视记录装置，则更直观地观察到细胞的变化。但由于这套系统较昂贵，所以应用尚不普遍。
' E# L6 A3 r( m5 g7 s  V: w0 T4 {　　四、离体活细胞染色观察
  C9 L1 P0 @7 Y! s　　1、 中性红染色
- k6 K& |, T# j* D　　 中性红是常用的活体染色染料，常用的浓度为1:10000，用生理盐水(或Hanks液)溶解后进行高压蒸气灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。; _5 P/ M3 R* S$ X2 \
　　2、 结晶紫染色" \! @' ^) d  ]$ S( Y+ ?* I
　　 使用浓度为0.1%，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。
4 I6 |: o" r; V- J2 ^+ }: d8 F　　3、 台盼蓝染色
) [) M# R2 H1 }0 t; D1 Z5 Z　　 用0.5%浓度的台盼蓝（Trypan blue）,用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。
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6 C1 j3 V0 ?) ]9 P# r9 ~　　第三节 细胞固定观察法
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　　体外培养细胞除可直接观察活细胞外，还可以用固定细胞的方法将细胞制成永久标本进行观察。固定染色观察，既可显示细胞形态，也可揭示细胞的微细结构，是细胞培养中常用的观察技术。其基本技术为固定染色和观察。- T8 d7 r: |0 w# b/ U% R
　　一、细胞固定基本方法& `/ w) L2 U9 p  z
　　无论用双盖片悬浮培养、加盖片单层培养还是悬液培养，都能将细胞固定染色，其中以盖片培养最常用。其步骤为：
, _% |2 \( y% ]　　（1）培养时加入一清洁盖片。
3 r) Y( U: Q9 {8 Y　　 (2)待盖片长满细胞或所需的适宜时期用镊子轻轻取出盖片，迅速投入37℃Hanks液中漂洗两次，每次3～5秒钟，以洗除血清防止其妨碍染色；如用悬液培养的细胞时，需离心(800rpm)，除去含血清的培养液，再向沉降细胞中加入少许温Hanks液，用吸管轻轻吹打漂洗后，留少许悬液，再做涂片，凉干后固定。4 a$ g+ B3 W; W6 r* ^% [2 O5 N" D; p
　　（3）固定 将上述玻片浸于固定液15分钟。常用的固定剂有甲醇/醋酸、FAA固定液、Carnoy。甲醇/醋酸浓度为甲醇3分，冰醋酸1分，现用现配，适用于观察染色体和Giemsa染色。FAA固定液浓度为：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福尔马林(40%甲醛，用时向瓶中加过量MgCO3中和)5.0mL。适用于盖片单层培养，固定效果好。Carnoy是较好的非水溶性固定液，浓度为纯酒精60.0mL，氯仿30.0mL，冰醋酸10.0mL，适用于显示细胞化学成分等方法，如粘多糖等，对固定培养单层细胞效果很好。但穿透力差。8 M) [$ ^; `8 ]1 s. U& l' X, C
　　二、常用染色方法
! }" X# d2 C4 z: h/ M' q　　1、H．E(苏木精一伊红)染色法4 `: ^" n% Y3 ?$ N
　　H．E染色法是细胞化学染色方法中最常用的一种方法。其基本原理是用碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，并能提供良好的核浆对比染色。) [+ D+ O  b+ N9 Q- f9 R
　　染色的基本材料为：
( t1 \. e+ A' X) Q3 \: r  p) z$ m　　苏木精染液
! T& S: v* |7 R  Y) ^( C& `1 c. l- n　　 苏木精 0.5g' f% B, z. `/ \8 r" ]) i
　　 溶于70mL蒸馏水中7 V$ D' B! w" w# M8 j  Y) p( Z
　　 铵矾(NH4)2SO4AL2(SO4)3 24.0g7 b* i6 j, T+ l# t# _
　　
" J3 z5 c& o* s4 ]/ C2 H& C　　 H2O 5.0mL 再加入甘油30mL和冰醋酸2mL混合均匀，/ c- ~; B7 Y+ v) ~3 V$ z( C# [
　　 NaIO3 0.1g 滤纸过滤备用。7 C5 F3 `! e* T
　　 伊红 0.5g 溶于100.0mL蒸馏水中。
3 l: u* N) G; e* N　　染色过程为：样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封固等。注意贴壁生长的细胞用盖玻片培养法制备样品；悬浮生长的细胞用离心甩片机制备样品。
. z/ W, O2 x/ X9 U* `　　染色的步骤(盖片培养法为例)：- U2 F4 z: x# S7 R& V
　　（1）用镊子轻轻取出已在培养瓶中培养一段时间，细胞基本长成单层的盖玻片，用37℃温PBS漂洗3次，每次20秒～1分钟；1 `4 ^# Y0 c/ l: ^% G
　　（2）将盖玻片浸入中性福尔马林30分钟；
9 d% A7 Z0 U" Y6 M0 \7 a+ e* G　　（3）PBS洗2次，每次1分钟，蒸馏水漂洗1次，浸入用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染色10分钟；
. ]- h+ J2 v/ c  f8 _/ Z　　（4）自来水浸洗，置入1%NaHCO3液中洗至蓝紫色；
! y# }# U# K; S5 m4 p　　（5）伊红水溶液中染30秒～1分钟；9 U" S& H5 T8 V1 l' v) b2 p
　　（6）蒸馏水洗，迅速通过丙酮2次，每次3～5分钟；
8 H" @; z& k# F' _0 g　　（7）通过2:1丙酮/二甲苯3次，每次1～2分钟；
" p, `: H; p9 P' t$ T! c& I　　（8）通过1:2丙酮/二甲苯3次，每次1～2分钟；6 u; ?4 N* t1 Z
　　（9）通过纯二甲苯5～10分钟；- ?  h* H! `; t# Y  Z$ F, a1 ]3 R
　　（10）把盖片细胞面向上，置载物玻片上，用树胶封存，再覆以较大盖片。
) F  |/ R5 y/ [9 Q4 j* T　　也可以用95%酒精作为固定液，用稀盐酸酒精溶液(75%酒精配制1%盐酸)作为分色液，用淡氨水溶液(在400mL自来水中滴2滴浓氨水)使胞核蓝化。其染色的基本步骤为：4 C/ f4 g+ g: E6 H' ~; E- k
　　① 将有细胞的盖玻片用温PBS洗3次后，浸入95%酒精固定15分钟。
! B% q$ I' @7 z6 u$ h　　② PBS洗2次，每次1分钟，然后浸入苏木精染液，染色5～10分钟。" f$ ^/ W0 I7 R/ g8 L
　　③ 自来水浸洗后，浸入稀盐酸酒精溶液，数秒钟，进行分色。7 q& Z& _+ R9 G3 P5 X" H. m
　　④ 自来水浸洗后浸入淡氨水中3～5分钟，使胞核蓝化。
0 L! D# N0 t9 k+ N7 k5 i! ]5 M　　⑤ 自来水浸洗后浸入伊红染液，染色5～10分钟。4 I* i- A" w7 L' s2 n; A" y
　　⑥ 自来水浸洗，经70%、80%、90%酒精各1次，95%酒精2次和100%酒精3次逐级脱水，每次1分钟。
+ o( c, {5 f  {; Y" O　　⑦ 通过二甲苯3次，每次1分钟。
8 U. J/ Y" Q; o' F: \　　⑧ 在载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上。& T5 p# t( p5 |: x* k
　　光镜下观察，细胞呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。
+ l0 n# T! ?/ ]  O0 ?$ t3 h　　2、Giemsa染色法
7 Q, Q; ?! t0 v4 O　　Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。其主要用Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。+ p4 D, c5 ^2 M7 C( a! n
　　Giemsa染色的基本材料为：0 J- Q1 _* b, u/ {, }
　　Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56℃保温2小时后，加入33mL纯甲醇，保存于棕色瓶内。# t0 D6 |) `5 V: o/ i
　　染色的基本步骤为：' p2 K, o. s4 _. i
　　（1）准备染液：用pH6.81～7.38的Sorensen缓冲液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液；2 D* G! n9 K. T. h4 j8 }+ j
　　Sorensen缓冲液的配制：
# l" |% E$ @) J$ u' b5 `/ R4 }; \　　pH6.81：Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL;
4 P' l# B" j8 i* v5 @　　pH6.98：Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mL: ]8 k$ r9 ]7 y& Z! y
　　pH7.17：Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL；
' n  H) S0 W" r+ U1 [　　pH7.38：Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。
# E/ u# o. f4 k% x9 d" F" w5 _$ U　　(2)细胞标本用甲醇固定10分钟，或用1:3醋酸/甲醇固定30分钟，用滴管把染色液布满玻片上，注意不要有气泡，用染色缸染色亦可，染10～15分钟；
! e0 y3 x6 [( i　　(3)用自来水冲去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。
$ H6 _6 ~" _8 P7 c; U( F　　染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。- Q1 L8 j0 i( ]3 g
　　Giemsa染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞浆成粉红色。& o& {- b  h* s7 Y0 I' @$ `' O
　　三、特殊染色方法# w, I- G5 c$ H3 \. M
　　随着组织化学和免疫细胞化学技术的发展，细胞染色方法也有了较大的发展。为了能够鉴别细胞中的DNA，Feulgen于1924年提出了Feulgen染色法。有些科学家把血清学方法和显微示踪方法结合起来又形成了免疫细胞化学染色法，如免疫荧光染色法和免疫酶染色法，这些为进一步分辨细胞的形态和细胞细微结构提供了更为先进的手段和技术。$ z8 Y+ f6 V3 s( e( s* K
　　(一)Feulgen染色法
4 g& z  f7 \, k, z, W　　此法的基本原理是细胞中的DNA在60℃用1N HCl酸解离脱氧核糖核酸，使嘌呤碱基与糖苷键破坏，嘌呤碱脱掉，脱氧核糖中的醛基游离，醛基能与Schiff试剂相结合，形成一种紫色的复合物。# ?# U' ^. L9 e( b, \7 m6 X5 Q
　　1、Feulgen染色的基本材料：
/ P/ E) d4 P, Q# w* J3 E　　(1)1N HCl：用浓HCl 8.5mL+蒸馏水91.5mL稀释。* C. t, }2 p% T0 _8 e: E. g
　　(2)Schiff氏剂：将碱性品红0.5g加入到100mL煮沸的蒸馏水中，再煮3～5分钟，冷却，过滤；冷却至25℃时，再加入1NHCl 10mL，偏重亚硫酸钠1.5g，装入棕色瓶中，盖紧，黑纸包裹存于暗处；漂洗液用10%亚硫酸钠溶液10.0mL加蒸馏水200.0mL，1N HCl 10.0mL，现用现配。9 r. q- w# a: W9 a: l; P& I7 u
　　2、Feulgen染色的基本步骤：; o8 _) z/ i, x  X) E; O  b
　　(1)将细胞置入培养瓶中培养一段时间，将长成单层的盖玻片取出，用Carnoy或醋酸/甲醇固定20～30分钟。
3 D2 `9 Q& z! e5 U2 {　　(2)室温下置入1N HCl 1～2分钟。
- a1 N8 I8 @; A% D* `. Z　　(3)再投入60℃ 1N HCl 8～10分钟。8 g1 Q( \7 O. j  z8 N7 ~
　　(4)在10℃暗处投入Schiff剂中染色1～5分钟。) o! S, X+ v6 S, s' C5 H2 r/ J
　　(5)取出在漂洗液中漂洗2次，每次2分钟。
$ I$ h1 c; K: W9 ^* k" k　　(6)在蒸馏水中漂洗2次，每次2分钟。; I. ~4 u0 ^, F
　　(7)用75%→100%的酒精依次脱水，每次1分钟。" [, u8 L( X. t* N4 c" ]
　　(8)用二甲苯透明2次，每次3分钟。
2 v: w" v7 x% C3 F0 o　　(9)用树胶封片，封实后盖片上加微型重物加压，置数日，树胶干后观察。
& G( X1 r. P* v( c, |　　本方法中酸的离解是关键，温度过低或酸度不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；反之，酸解过分，导致DNA完全解聚，染色反应会减弱。细胞中RNA对酸比较稳定，醛基难游离，不被着色，故此法能对DNA进行特异性染色。
6 d$ ~8 z" {- m" B( m　　Feulgen染色后，细胞核成粉红色至紫红色，胞质为无色。3 Z$ P; v% r) F! O! D- j
　　(二)免疫荧光染色法
& K2 {+ ~( t' {  s9 \　　此法基本原理是将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。1 |. e8 Q' B( \0 U0 B* S
　　1、主要使用材料
9 ~: y. u# Z7 I: d　　(1)0.01mol/L PBS 称取NaCl 8g，Na2HPO4. 15g，KH2PO4 0.2g,加蒸馏水至1000mL溶解后，调pH至7.2。
/ C: [# e8 C$ k! K( Q7 [. z　　(2)0.5mol/L硫酸盐缓冲液(CB) 称取NaHCO3 3.7g，Na2CO3 0.6g，加蒸馏水至1000mL，溶解后调pH至9.5。; q( z& u2 P0 u" r/ j5 t
　　(3)50%缓冲甘油 1分纯甘油加1份CB。" ]( g/ n9 i2 W/ l9 Y
　　(4)伊文氏蓝溶液 称取伊文氏蓝1g，加入100mL PBS中，溶解后加1mL 1%NaCO3过滤；4℃保存。临用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀释成0.01%浓度使用。; |+ [) F* U1 c' W0 j9 Y. V
　　(5)特异性抗体(第一抗体) 荧光素标记抗体（第二抗体）。! J; Z, u! d9 |
　　(6)染色缸、湿盒、振荡仪、荧光显微镜。1 j2 r0 v( ^$ R$ L
　　2、染色的基本步骤
* l. m# ~; ?: o& R　　(1)细胞准备 将7mm×22mm盖玻片置入培养瓶中，加入对数生长期细胞悬液于培养瓶中，待细胞长成单层，取出盖玻片，用PBS洗2次；悬浮生长的细胞离心后用PBS离心洗涤2次，制成细胞涂片。6 D2 o9 D! \, z& m3 _/ k. Y' |7 v, d
　　(2)细胞固定 用醋酸/甲醇或95%酒精固定20～30分钟。7 p" u0 G. W# ]: B
　　(3)将固定的细胞玻片置入盖片染色缸，用PBS振洗5分钟，取出吹干。
, C3 ?% g$ n* t6 _/ ]( }( ^　　(4)滴加稀释的荧光素标记抗体(0.01%伊文氏蓝溶液稀释)，在湿盒中37℃保温30～60分钟。1 J; ^. S9 _; a/ [8 s
　　(5)PBS振洗2次，每次5分钟，然后用蒸馏水振洗1次。
3 a4 `. x0 I$ B: K　　(6)用50%缓冲甘油封片。7 \1 S' F  P- v! V  f8 D- @
　　标本染色后应及时观察并照相，若暂时无时间观察则应将标本放入4℃冰箱保存。但过夜后特异性荧光会减弱。如用聚乙稀醇封片，则保存时间可适当延长。制标本和染色时必须设立阳性对照、阴性对照、空白对照及抑制试验，以排除非特异性染色。要控制显色反应时间，以阳性反应着色最强，而有的是刚开始着色为佳。滴加抗体的量要适当，防止液体干涸。, @# n+ n. Z; A
　　此种染色法在荧光显微镜下观察，阳性部位出现荧光。荧光素种类不同可出现不同颜色的荧光。如异硫氰酸荧光素呈黄绿色荧光，罗丹明B220呈橙红色荧光。
5 i0 m) E% a* c4 {/ b* D　　(三)免疫酶染色法  ^* ~& F6 t- j
　　ABC免疫酶染色法即卵白素—生物素—酶复合物法，是目前最敏感的免疫细胞化学染色法之一。其基本原理是将特异性第一抗体与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化桥抗体与第一抗体结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。此法灵敏性高，对比度佳。+ N6 \/ `# q9 [+ ?5 D9 ]$ o+ C4 g2 g
　　1、 使用的主要材料
, O% Z) Q5 c* C. B8 Z1 e　　 磷酸盐缓冲液(0.01mol/L, pH7.4 PBS)；Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L, pH7.6 THB)；底物溶液[临用前称取50mg3.3'二氨基联苯胺(DAB)，溶解于100mL THB中，过滤，然后加20uL 30%H2O2，及时使用]；ABC试剂盒(美国VECTOR公司产品，包括正常马血清、生物素化马抗小鼠IgG或马抗兔IgG、卵白素—生物素化辣根过氧化物酶复合酶)；小鼠(兔)特异性抗体；盖片染色缸、湿盒、显微镜等。
$ R: `" Y4 R- v8 T3 v5 B0 x　　2、染色的基本步骤/ I; u0 n8 F0 f7 ]8 d5 _
　　(1)细胞准备与固定，同免疫荧光染色法.5 f" v5 r( D" ~7 n, D
　　(2)取已固定的细胞盖片,用PBS洗5分钟,浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 5mL+PBS 200mL) 37℃3分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
9 ]; W3 F8 y- ^2 ?　　(3)PBS振洗2次，每次3分钟。' N6 m' J+ Z: F0 i1 Z, [0 H
　　(4)滴加正常马血清，在湿盒内，37℃保温30分钟，以消除非特异性染色。
* d/ y5 a# B( X& _% T3 U) W　　(5)弃去正常马血清，滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30～60分钟或4℃下过夜。" I' r9 q2 s$ l6 t7 Q
　　(6)PBS振洗3次,每次3分钟,滴加生物素化马抗小鼠IgG，在湿盒内37℃30分钟。% e+ q9 |) ]" ^" ?2 e
　　(7)PBS振洗3次，每次3分钟，滴加ABC复合剂，在湿盒内37℃30分钟。
$ l9 ~' X( }! a% U+ e9 F- H+ V/ c　　(8)PBS振洗2次，THB振洗1次，每次3分钟，浸入新鲜配制的底物溶液，在室温下置暗处10～20分钟。
3 w& L% N" Z* X. f　　(9)自来水洗5分钟(若采用显微分光光度计进行定量分折，则无需作细胞核衬染，直接进行脱水、透明和封片)。
6 y1 G9 C: a9 m　　(10)细胞核衬染 浸入苏木精染液染色2分钟，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
, [" V* K6 o* U. Q; I　　(11)逐级脱水 过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1分钟。( m4 ~. G* k2 M/ U/ ]
　　(12)透明，过二甲苯溶液3次，每次1分钟。
" [1 r% R( g3 {' Y3 |$ E　　(13)将有细胞的面向下，用中性树脂封片。
/ W% d! b4 \; A& E; S2 x* E% I　　此种染色方法同免疫荧光染色一样，也应设置阳性对照、阴性对照、空白对照和抑制试验。空白对照用PBS做第一抗体。抑制试验是将待检标本与未标记特异性抗体反应后，再用自己标记的特异性抗体进行染色，结果阳性强度减弱或转为阴性。其注意事项同免疫荧光染色法。
$ ]7 C5 U7 h  a1 k" ]& g6 b　　此法染色结果在光镜下观察，阳性部分呈棕褐色。, ^2 C& ~) H. G
　　(四)细胞银染色法4 W6 ?; p& [# G/ m2 |* }( c. I
　　此法用于嗜银蛋白分析。其基本原理是：核仁形成区(nucleolar organizer regions NORs)是位于某些近端着丝染色体短臂上含编码核蛋白体RNA(rRNA)基因rDNA片段的环状DNA。这个区存在的相关嗜银蛋白(Ag NORs)是核仁内高度磷酸化，并对银有亲和作用的酸性非组蛋白，对rDNA的转录、rRNA合成、加工和装配起着重要的作用。AgNORs的含量可反映细胞增殖活性，其含量越高，表明细胞增殖越快。用银染色法能特异显示细胞AgNORs，通过计数AgNORs颗粒和测量AgNORs面积，可定量分析细胞AgNORs。- H$ H' D5 ]# z, W
　　1、 银染色法需要的基本材料
. p. q7 g3 A- B; [* o　　 50%硝酸银和1%甲酸(v/v)需用去离子水配制；2%明胶甲酸溶液(称明胶2g，溶入1%甲酸溶液100mL)；应用染色液(在暗室内将2%明胶甲酸溶液和5%硝酸银溶液按1:2的容积比混合)需在染色前新鲜配制；洁净的盖片染色缸、吸管、载玻片、镊子等。6 @' v) q3 G4 M% q
　　2、染色的基本步骤
7 b/ N2 @+ V( K　　(1)细胞准备与固定同前。' H7 D) K: ~; p
　　(2)固定后的细胞玻片浸入去离子水中使其水化。0 x; }0 Y" ]/ f6 X
　　(3)将应用染色液滴加于细胞玻片上，室温下避光染色1小时。
- \( N# G; Q4 ]3 L% Q2 e" \　　(4)用去离子水反复冲洗，95%～100%系列酒精脱水。
: @$ z# z1 c9 l6 \! q: d7 ^" b6 q3 q, k　　(5)用二甲苯透明。
" |; E& n' e# U6 P　　(6)中性树脂封片。$ G. z$ L8 l5 Q/ L' B4 p
　　染色液配制一定要用去离子水。注意染色时间，不同组织标本染色时间不同，其长短直接关系到AgNORs颗粒的计数结果，特别要注意。计数时每例样本不得少于30个细胞数。
, R9 d- ~8 @, r3 ]) h　　染色片在光镜下可见到细胞核内散着大小不等的黑色颗粒。定量分析可用目镜形态定量学方法和自动图像分析法。前者采用0.5网形目镜测微尺测量细胞核AgNORs颗粒数，以相互不连的颗粒定为一个计数点。后者采用图像分析仪自动定量分析，先在光镜下对待核细胞定位，通过摄像系统将细胞图像信号输入计算机，计算机对每一视场的颗粒个数及每一颗粒面积进行自动识别和计数。
$ W  |5 ^4 H$ R. G- I　　(五)考马斯亮蓝(Coomassie, BB)染色法; Y) k! W( x! d. c1 s
　　这是一种显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法。9 K3 A1 A7 ^- ?3 m  G8 F
　　1、 需用的材料
) u+ r" j' {$ r# f: ?$ [5 n) |# J　　 固定液[0.1mol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)14.0mL, 0.1N磷酸氢二钠(NaH2PO4•12H2O)36.0mL，加蒸馏水50.9mL，相混合后再加25%戊二醛50.0mL]；染色液(甲醇46.5mL，冰醋酸7.0mL，加蒸馏水46.5mL，相混合后加考马斯亮蓝染料0.02g)。
* B! z; C6 O, Y+ o9 t! J) o) x3 ~　　2、染色的基本步骤
+ S7 a' O5 k7 d: M  M　　(1)细胞准备 用支持物盖片培养法，待细胞长满70～80%。# K7 _5 \! s1 b
　　(2)将有细胞的盖片从培养瓶中取出，投入固定液中固定15分钟。3 |/ J9 T0 _9 z" M6 \$ p3 h
　　(3)先置蒸馏水漂洗2分钟，再用蒸馏水冲洗两次，每次1分钟。
! v  }  i) t$ P: j% M: s1 h　　(4)置入考马斯亮蓝染液中染色60分钟。1 b8 Q0 L; u7 D# {) N- ?* E
　　(5)先置蒸馏水漂洗2分钟，再用蒸馏水冲洗两次，每次1分钟。# [( P, T. [& |8 r) q& x, ~
　　(6)置入含甲醇冰醋酸液碟皿中(不含染料)，在倒置显微镜下观察可见细胞质内微丝逐渐明显，背地清亮时终止。
( z3 v- u& M; z8 V% M  f　　(7)按(3)方法漂洗。
4 Q3 Q+ n& N6 C& }* v/ d　　(8)用70%～100%酒精逐级脱水。
, Y/ g" B) A) T  V7 y) s　　(9)用二甲苯透明。
% x2 i: ^5 z0 ]+ ?/ Y　　(10)用树胶封固。  E+ n& }8 {+ Q
　　染色清晰的关键在第(6)步，要特别注意。染色片镜下观察，细胞内微丝呈现蓝色。4 a- k6 U) S  X( ^
　　  K/ B+ \+ U4 o7 K- S# U2 G% E8 D
　　第四节 细胞生长状况有关指标的检测方法
. R0 p3 A/ \2 g# Y: c* z　　, c( p4 H& n, L# J4 Y
　　一、细胞计数% s; Y& Z. |# R8 P1 }
　　这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
3 f& [$ |4 s  W( i! x2 u　　细胞计数的基本步骤：9 I! ^. J0 R( Q6 o; N8 ^
　　(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.
- h: W) T% Q; K  g: \, ~  T: j, A　　(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.. P7 v  _) V2 I: r0 b* E1 D
　　(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。- {) j* w' M4 i: D% ]* p, S  {6 Y
　　 细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数  z7 V* ~+ B8 e
　　台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
' A  ^# _6 P9 G+ t" Y; _6 V　　 细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%: V4 l' q" r4 W0 B9 ?
　　细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。7 i, g% {* |  k. F% B* H  z' B
　　在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。
. d2 h1 I! ~$ i4 }8 {5 S2 a) K, v　　二、细胞生长曲线和生长倍数3 J  k$ X! e  r+ t' z4 x0 [
　　细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
- a# t( Z2 f4 `5 ?8 D$ R　　测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
; F1 `( J; `1 x  i7 s3 T　　也可采用MTT法来进行生长曲线测定，较上述方法简便。
; k" F/ V! m1 H7 E0 @　　标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老。
, D1 f' d% i, r* }1 e& Z　　细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率。' K  `" G% k  F) q
　　 生长倍数=培养后最大活细胞浓度/接种时的活细胞浓度
- e# \. t+ ]+ m! T  x1 z! D3 c$ B　　三、细胞分裂指数
( b5 j+ C- I( x7 S) h; P　　细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为：用秋水仙素将细胞处理1～2小时后，按染色体制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。9 W7 p& ^5 e- I( M' Z' G" w& Z
　　基本步骤：
- |4 K: n! _( ^* |' T  x7 |2 }　　(1)细胞准备 用盖片(支持物)培养法。
) l/ F% I5 z. Z1 h. `7 e7 K　　(2)每24小时取出一个小玻片，按常规方法进行固定，吉姆萨或HE染色，封片，制成永久标本。% m- |3 z6 l6 o! Y9 h% Q
　　(3)显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞多、中、少3个区域各一区，共数1000个细胞，计算出平均分裂相值所占百分比。观察时要掌握好分裂相标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差。3 Q9 r9 w9 @: g$ {' J' N* y* S) K' V. s
　　 细胞分裂指数=细胞分裂相数/细胞总数(1000)×10001 V0 e  |* x/ l6 G5 U, d4 q1 |
　　四、细胞接种存活率5 H1 v+ p$ F7 S* ~. _
　　细胞接种存活率又称细胞贴壁率。它是细胞被制成分散的悬液后，以低密度(2～5个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力。
* r4 H6 C5 w; n+ l' n　　基本步骤：! p' l- u& v( n6 R; N% \' K/ w/ D
　　（1）取对生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶(浓度相对高些)。接种12～15瓶。) W7 |: g2 P2 H+ X3 P
　　（2）每2小时取出一瓶细胞，倒掉培养液，然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面公式逐个计算每个时间上的贴壁率。每2小时一次，共观察24小时即12。) ?7 A5 ?# J' n
　　 接种存活率%(贴壁率)=(贴壁存活细胞数/接种细胞数)×100%
! Z+ l! L' `: L- n, Q7 Y& `+ z　　五、克隆形成率  ?5 `) j* Z( U$ i' Q
　　细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。0 W5 C2 R0 W* Y0 |: w+ Z, e
　　1、平板克隆形成试验
' @* ~, N, N- H5 h　　基本步骤：
! R0 K' ^% n* Q/ Y1 ~　　(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。- c2 A. o+ R7 D% U! b3 y, E. d
　　(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。3 V* h5 I% y  J) `
　　(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
  N  ~& w! j8 d9 N8 t- D　　(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
) r+ [. E" T3 x5 w9 C　　" F8 D& h# F. i: G7 x
　　 克隆数  q- G: g. K! x% E* L
　　 克隆形成率= —————×100%
, ~) f+ p3 G- K　　 接种细胞数# w; q% y# t5 |  o6 L* O9 \% H
　　% G' Y! |# x) o9 l
　　平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。$ J0 I, ?& o; l3 k8 y" f
　　2、软琼脂培养克隆形成试验
. n9 w8 q$ F! E- s8 p5 d" R　　基本步骤：: H3 x  B( m* u8 `6 n4 L, L2 N6 A& {
　　(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
  l9 a3 g! B' U/ j　　(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
' s# w, d1 L% q  u' a　　(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
4 x9 t4 D2 L/ E' p* M　　(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。8 z/ R3 P* [+ O3 s& V: K- B
　　(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。; J* n- R7 u. j. {+ g
　　软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
# q- z. s% I0 q- J　　4 e/ Y+ O6 E( T
　　第五节 细胞化学检测法: ]  T( n* O8 S
　　& U1 q% ]% D  F- k/ e2 X5 _6 ~
　　一、四唑盐(MTT)比色法/ I$ b  N9 r9 l8 S" }
　　检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色试验(MTT)。由于这种方法与细胞计数法、软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验有良好的相关性，且灵敏度高、重复性好、无放射性污染等，所以常用于细胞活力的检测。此法的主要原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞毒性试验和肿瘤放射敏感性的测定等。1 B+ [7 q: R* U, }4 @
　　基本步骤：
6 ^, \( _+ I4 i' w' X　　（1）用0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成1×109细胞/L的单细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μL。
! q' M. w4 q) W' d　　(2)将培养板置CO2孵箱中，在37℃ 5% CO2条件下，培养3～5天(根据实验目的而定)。
& v4 f& v  f/ F1 w6 {% g, z: W5 s6 I　　(3)培养3～5天后，每孔加入MTT溶液(将MTT按5mg/mL溶于0.01mol/L，pH7.2的PBS中，轻轻吹打至全部溶解，过滤除菌，4℃避光保存，保存时间一般不超过两周)10μL，继续置培养箱孵育3～6小时，终止培养，加10%SDS-HCl 100μL/孔37°C数小时，将细胞内和细胞周围的MTT一甲月赞 颗粒充分溶解。
  _% {6 E6 M) `　　（4）用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值(OD)，选波长490nm。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。' R& f2 a" k6 y0 @3 S' n
　　用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不至过满。另外，试验时应设空白对照，比色时，以空白孔调零。8 u, O) P3 P  ]2 ~
　　二、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法)
; F. [6 o9 X2 b) L  ~6 ~! K* J: D　　此法基本原理是：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸收，其光吸收值与蛋白质含量呈正相关。此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。
& Y+ R  m- O$ p  C) N　　基本步骤：
  U! f' k3 B# i% Y% `- W- u2 ~　　（1）用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成悬液，用10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×104细胞/mL，接种于24孔培养板，每孔1mL，置37℃ 5%CO2条件下培养一定时间。
; w1 n4 C( e" l( s, R7 w　　（2）用胰蛋白酶消化分散，培养板的细胞悬浮在PBS中，计数细胞数，取106细胞以1000r/min离心5分钟，弃上清液，加0.5ml 0.1%SDS或0.3mol/L NaOH，置100℃煮3分钟，使细胞裂解。7 j( g$ r. e2 D+ K
　　（3）取0.1mL考马斯亮蓝染液与100μL上述细胞裂解液混匀，放置10分钟。
# J: h. n# @" m3 q/ a6 U( d: |　　（4）用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的光吸收值。以溶剂为空白对照，以已知量的牛血清蛋白蛋白（BSA1～50μg）为标准品，绘制标准曲线。然后根据标准曲线推算样品中蛋白质含量。/ o0 R  ?0 B. b; e4 {8 Y7 s* P
　　三、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验
& c+ D( b' E# m0 o　　此法的基本原理是，细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。
/ b- X6 }) Q! R' ~) l　　基本步骤：5 G; s. p1 u9 u6 p& f2 H5 V
　　（1）取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞密度至107～109/L，接种于24孔培养板，每孔1mL。
  o5 M( A6 [, d1 ~' A　　（2）将培养板置37℃ 5% CO2孵箱中培养至细胞处于对数生长期时，每孔加100μL预温37℃的3H-亮氨酸(终浓度为1.85×108Bq/mL)。
) y. x* r% Z% K" q　　（3）继续培养4～24小时(根据预先摸索的掺入时间定)。
3 @) o2 I+ R0 s0 R7 g/ a　　（4）终止培养，取出培养板，小心吸出培养上清液，用预冷的PBS小心洗涤，晾干。如果细胞松散，可先用甲醇固定10分钟。
, T3 h" Q; t/ ^- P0 T9 p* [　　（5）把培养板放在冰盖上，每孔加1mL 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10分钟，吸取上清液。9 q# C$ P4 a' c7 Y2 C, ^
　　（6）用甲醇洗涤、晾干。
9 B& J0 W% G! {, O# D　　（7）每孔加0.5mL 10.3mol/L NaOH，1% SDS,室温下放置30分钟。! ?( m, F: G8 L
　　（8）混匀、移入闪烁瓶中，加5mL闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分脉冲数(cpm)，以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示。# X1 ]8 l0 W  _; a" \! q& Q( M, l
　　对悬浮生长的细胞则采用离心法处理。
$ U. K1 J1 ?1 v; p　　四、细胞DNA合成测定
" G" R  v0 Q1 D5 e! t　　(一)3H-TdR掺入法
* D9 W# E% N: Y  @　　此法的基本原理是：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质，。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。3 }0 t$ q- T% v: w
　　基本步骤：1 A& X& _+ V8 F" \4 a# i: r
　　（1）取对数生长期细胞，制成3×108细胞/L的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1mL。# N, R, s% a0 x8 d) b& m& g
　　（2）将培养板放入37℃ 5%CO2孵箱中培养24小时左右。
, Z8 \, C% u; ~  [" H: `6 ]0 p　　（3）在细胞处于对数生长期时，每孔加入100μL 3H-TdR(用HBSS配制3.7×108Bq/mL浓度，过滤除菌)，使终浓度为3.7×107Bq/mL。8 s  }8 A9 \+ {, f. t2 q
　　（4）继续培养1～24小时(根据实验要求确定)。% K$ G7 p/ I  y  o+ G
　　（5）终止培养，小心吸弃培养上清液，用HBSS漂洗单层细胞2次，然后加2mL预冷的10%TCA(三氯醋酸)，放置10分钟。如果细胞松散，应先用甲醇固定10分钟。再用10%TCA重复洗2次，每次5分钟。1 B1 `$ {) E6 ]  M+ z2 n
　　（6）每孔加0.5mL 0.3mol/L NaOH,在60℃处理30分钟，然后使之冷至室温。
- x! ], X  j9 {2 H, U　　（7）收集上述裂解液，移入闪烁瓶中，加5mL闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm),结果以cpm/106细胞表示。
5 R" k# k( ?& I/ r& X　　(二)流式细胞仪测定DNA合成; S7 f; a3 z- H/ z8 z( T9 @
　　用流式细胞仪测定细胞增殖同期和DNA合成是90年代发展起来的新手段，不仅快速、准确、效果好，而且消除同位素标记的许多繁琐方法和放射性污染。+ W$ z8 j0 I# J2 g9 w
　　基本检测程序：/ Q5 P5 n0 _& i7 ^. B
　　（1）取80%至接近汇合的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备成单细胞悬液，细胞密度1×109细胞/L，注意不能留有细胞碎片。/ b. R5 `$ e) M1 u8 D. T
　　（2）进行流式仪检测。除检测细胞周期时相变化和反应DNA合成情况外，还可了解染色体倍性；结合荧光免疫法，还可对细胞膜进行分析等。( W" ~6 N  k4 a% t, b$ N  r
　　4 Y4 H; h1 B; p# I2 ^( ?& k$ k
　　第六节 电 镜 观 察 法. ?! B! C  W0 A  Q- K
　　6 o" |# e7 F- G% {
　　电子显微镜的诞生和发展大大推动了人们对微观世界的研究。借助电镜技术，人们可以认识亚显微结构和超微结构。离体培养细胞具有活力好、层次薄和易于取材、固定效果好等优点，非常适宜于电镜观察。随着电子显微镜技术的发展，当今的电镜技术已包括了透射电镜超薄切片技术与观察，扫描电镜样品制备技术与观察，电镜细胞化学技术，电镜免疫细胞化学技术，电镜X射线显微分析技术和电镜图像立体定量分析技术等，既可观察细胞形态、结构，也可了解功能，并进行定性与定量分析。  w+ I$ C& ^3 y
　　一、透射电镜细胞样品制备技术和观察方法
; s# Y2 \# C5 P: j1 s* {; j( V$ Y　　(一)原理% z8 W% N% ?0 }8 h& G
　　透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)是利用阴极发射的电子，通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号，经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍，最后成像在荧光屏上便可即时观察，或是投射到照相底片感光片上作为永久记录。由于标本必须置于高真空中进行电镜观察，所以电镜观察的生物标本必须特殊制备，不能含水，离体的生物标本要迅速加以固定，以防产生结构改变。另外，电子的穿透力很弱，这就需要把样品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一个细胞切成100～200片)。为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片，并使切片耐受高真空和电子轰击，所以在切片前要进行包埋。超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键。
) K: S$ B' K: P; W　　超薄切片制作样品过程大体分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色等。细胞超薄切片技术中如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来是最大的难题。新的定型产品无菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解决了这个难题，把薄膜放在培养瓶皿中，让细胞直接长在塑料薄膜上，不仅细胞生长效果好，而且可与细胞一起包埋切片，省去了许多麻烦。
) C0 v" k& ^7 c2 ~* e" `3 m% L　　(二)超薄切片基本操作步骤; Q% f5 i& d1 T
　　1、取材! k2 t' U" P, z# c8 ?/ D
　　(1)离心法 适用于悬浮生长细胞或单层生长细胞，欲观察细胞内部超微结构，取对数生长期的细胞低速离心，令细胞沉于锥形离心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定。5 @, F3 M) k- q: r0 n
　　(2)原位法 将无菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包装的成品)剪成适宜的小块置入培养瓶中，然后接种细胞悬液，待细胞附于薄膜上并生长后，取出进行固定。
6 [. W; V, s, s/ S: W　　2、 固定
+ T) n/ N' N- {　　 将离心管中的细胞团块或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分钟。再用1% 四氧化锇在4℃固定15～30分钟，接着用PBS漂洗3次。, v$ i( Q$ g7 r
　　3、 脱水
# |' m+ l' ~7 m2 ^4 v- b6 N　　 用系列丙酮在室温下脱水。" ~# D$ r) H5 f6 \* m, g
　　 50% 丙酮溶液1次，10分钟。. U1 c4 v# o2 Z# K3 E. w9 q
　　 70% 丙酮溶液1次，10分钟。% {, [$ |6 X: I+ b1 _' J
　　 90% 丙酮溶液2次，每次10分钟。
) r1 r* |  G8 X! O) j　　 100% 丙酮溶液3次，每次10分钟。0 I" @" p9 m, q4 ?) F$ \
　　4、 浸透( ], M* R6 ]" h4 `2 c3 f; A$ {4 Y% U  A9 A
　　 吸弃瓶中脱水剂，加3mL纯丙酮-EPON812包埋剂(1:1体积比)，室温下放置30分钟后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1mL，室温放置2小时或过夜。; `' J) s' [0 r7 ]! t
　　5、包埋
4 ]: U# c) _: g! X1 `' n5 U　　(1)细胞团块 吸取混合包埋剂滴2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注满混合包埋剂，放60℃烤箱烘烤2小时，使之固化成硬块。  D; L  D  O5 |2 |& @8 h2 Q
　　(2)细胞薄膜 将预先干燥的EPON明胶囊注满混合包埋剂，倒盖在单层细胞上，在60℃固化24小时。
+ A  @  g9 x  `　　6、修块 将包埋块安装在特制的夹具上，在显微镜下用单刃刀片修整去除表面的包埋剂，并做记号以便定位。
; m+ [7 Y  A6 h6 d9 ?9 h7 X# @( e' M- W- p　　7、切片 先将包埋块固定在超薄切片机上，切厚约1μm的半薄切片，用苏木素-伊红染色法染色。镜下观察细胞图像，确定进行超薄切片的部位，并作标记。准备φ3mm，150～200目的铜网，用清洗液清洗，并用无水乙醇脱水干燥。制备好支持膜，小心放在铜网上。在超薄切片机上安装三角形玻璃刀，固定包埋块，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛笔挑选切片并用钢丝环套取切片，贴在铜网有支持膜的一侧，保存在干燥器皿中待染色。
. w4 s( v1 T/ o7 F$ h5 }　　8、电子染色：用一干净培养皿，内放干净的牙科石蜡片。在石蜡片上加1至数滴醋酸钠染色液，用镊子夹住载网边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿染色5～30分钟，染色后尽快用双蒸水清洗三次。用滤纸吸去载网多余的水分，置培养皿内自然干燥。再将载网放在另一只备有蜡片的培养皿中以同样方法进行柠檬酸铅的染色及清洗。片染后凉干待观察。
+ t9 q; k$ H! ]8 J! w　　二、扫描电镜细胞样品制备6 f* S, O7 V% J' b/ ^2 F* c: K1 R
　　(一)原理4 G  t+ |" Q/ {0 m5 R8 V
　　超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞的三维结构，而且在观察由切片所拍摄的显微照片时，容易造成错误的印象。用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)能直接观察标本表面的三维空间结构，真实地反映各种细胞表面和断裂面的形貌特征。其照明源与透射电镜基本相同，由电子枪发射的电子束经聚光镜会聚成极细的电子探针，电子探针受扫描发生器控制，在样品表面逐点逐线地扫描，样品被电子轰击所产生的二次电子被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。二次电子的发射量与样品的表面形貌有关，从而在荧光屏上出现表面起伏的样品的立体图像。扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水等。
$ A( C0 }$ z& Q! L6 F( B" E　　(二)基本步骤
7 i. J- k: W+ p/ ?% o% x6 f, w　　 (1)取材 一般原则与超薄切片相似，但用于扫描电镜观察的样品块略大，通常为5×8mm左右。0 f6 j+ w3 w/ x1 Y
　　(2)固定 铺片培养的细胞取出浸入PBS中，漂洗细胞表面。然后将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小时或过夜，吸出固定剂，用PBS浸洗2次，每次10分钟，再用4℃预冷的1% 锇酸，在4℃固定1小时，然后用PBS浸洗2次，每次10分钟。  I& B# d3 C( A+ r
　　(3)脱水 丙酮/醋酸异戊酯(1:1)10分钟，接下来醋酸异戊酯30分钟，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脱水，每种浓度酒精通过2次，每次15分钟。: c" |+ o: H2 s$ n
　　(4)干燥 以临界干燥法最理想，但必需要有专门的仪器，当实验室不具备此种仪器时，可采用冰冻干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的关键是乙腈置换。样品经上述处理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更换70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分钟，最后再换100%乙腈。然后进行真空干燥。即将乙腈置换后的样品连同青霉素瓶一起放到真空镀膜台的空中置内，抽低真空，一般需30～50分钟。样品干燥后，待其温度升至室温时再放气，取出样品。
* ~3 U/ e+ z- f% i& ?' B  T　　(5)样品导电处理：用真空喷镀法。所用仪器为真空喷镀仪，样品被安置在离蒸发源约10～15cm处的样品台上，样品进行旋转活动，先喷碳，后喷金，喷镀应均匀，完成后待镜下观察。
6 q: v& s' J7 \; g　　

deshenglll

很好。谢谢。

chuanbaozang

存下来，谢谢了

chuanbaozang

存下来，谢谢了

透明微笑

学习了

afanti360

很全 谢谢

267241372

谢谢啦！