小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植模型大鼠淋巴细胞的免疫抑制及损伤修复作用的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:28 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李秀东  陈玉丙  陈强  宋祥福  张红梅  范洪学作者单位：吉林大学公共卫生学院毒理教研室，吉林  长春  130021 - K. Q: {; z6 G; e% T1 v/ @& W5 z8 i



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      【摘要】  目的  探讨异基因骨髓间充质干细胞(MSCs)应用于移植及自身免疫性疾病的治疗时替代免疫抑制剂的可能性。方法  体外分离纯化及培养小鼠MSCs；将小鼠肝组织块埋入大鼠肝脏切口，制备异基因肝移植大鼠模型；制备模型前后经尾静脉注射小鼠MSCs；通过体外淋巴细胞增殖实验检测其对模型大鼠淋巴细胞增殖抑制作用；采用HE染色方法观察小鼠MSCs对异基因肝组织移植大鼠肝组织损伤的修复情况。结果  MSCs治疗15 d大鼠胸腺和脾脏均出现淋巴细胞增殖抑制现象，与对照组相比存在显著性差异(P＜0.05)；MSCs治疗2 d和5 d肝组织染色显示移植区域浸润的炎性细胞减少，可见肝组织结构。结论  小鼠MSCs具有抑制异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的作用，并参与移植区肝脏组织的修复。
      【关键词】骨髓间充质干细胞；异基因移植；增殖抑制
   　　近年来，关于干细胞的临床应用开展的很广泛，干细胞移植为老年人常见疾病，特别是心肌梗死、帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病、终末期肝病及恶性血液病等难治性疾病提供一个具有突破性的治疗方案。但干细胞移植前要进行大剂量的放、化疗，而且异基因干细胞移植后为防止移植物抗宿主病的发生，需长期服用免疫抑制剂，老年人无法耐受〔1〕。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是存在于骨髓基质内的非骨髓间充质细胞来源的细胞亚群，具有多向分化潜能，在体外特定的诱导条件下，MSCs 可以最终分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、神经细胞及肝细胞等〔2，3〕，可作为细胞治疗的种子细胞。近年研究发现MSCs只表达少量MHCⅠ型分子，而表达极少或不表达MHCⅡ型或T细胞共刺激分子B7〔4〕，具有抑制T细胞增殖的作用〔5～7〕，因此在理论上，MSCs移植有可能解决异基因移植排斥反应及移植物抗宿主病等移植相关问题。本研究拟通过体外淋巴细胞增殖实验检测小鼠MSCs对异基因肝移植大鼠淋巴细胞的增殖抑制情况及对大鼠肝移植区肝组织损伤修复作用，以探讨MSCs诱导免疫耐受，用于老年病细胞移植以代替免疫抑制剂的大量应用的可能性。

　　1材料与方法8 U: W- l+ ^; n! R$ M7 W. Q
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　　1.1材料DMEM培养基( L-DMEM，GIBCO 公司)，胎牛血清( FBS，hyclone公司)，胰蛋白酶(GIBICO 公司)，DAPI(sigma公司)，ConA（sigma公司），3H-TdR(北京原子能研究所)，CO2培养箱（SHELLAB公司），超净工作台（无锡沃尔盖茨科技有限公司），液体闪烁计数仪（Beckman 公司）。出生5 d的健康昆明小鼠乳鼠、成年健康雄性昆明小鼠及5周龄健康雌性Wistar大鼠，体重230～250 g，由吉林大学实验动物中心提供。实验鼠在洁净环境中饲养。
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　　1.2方法

　　1.2.1MSCs分离、纯化与体外培养将出生5 d 昆明小鼠乳鼠颈椎脱臼处死后，以75%酒精浸泡5 min，无菌分离股骨、肱骨，剪除骨两端，用5.0 ml L-DMEM培养基冲出骨髓制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0105/ml，接种于培养瓶中，置37℃、 5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。72 h后弃除悬浮细胞，加入新鲜培养液，2～3 d换半液一次，至细胞接近融合时，以0.25%胰蛋白酶（0.1 ml/cm2）消化1～2 min，血清终止消化后制成单细胞悬液，按1.5104/ml传代，显微镜逐日观察，反复传代扩增纯化MSCs。取第3代以后的MSCs制成单细胞悬液，细胞浓度为1106个/ml，以备输注给大鼠。5 ^: l; m4 S$ x+ y$ F% h; t. z! O# f  W! |

　　1.2.2模型制备将雄性小鼠肝组织块移植给雌性Wistar大鼠。将大鼠以水合氯醛麻醉后，消毒胸腹部，剪去剑突下毛(34 cm)，反复消毒后开腹暴露肝脏，选择下叶肝脏，在被上叶覆盖处作一切口，将雄性小鼠肝组织块(22 mm)埋入切口后，逐层缝合腹部，术后连续4 d注射青霉素。将实验动物随机分成四组：①对照组：未作任何处理；②模型组：只行肝移植术，不予任何治疗措施；③前治疗组：给大鼠经尾静脉注射小鼠MSCs 17 d后行肝移植手术；④后治疗组：行肝移植术后第2天经尾静脉注射小鼠MSCs。
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　　1.2.3胸腺和脾细胞悬液的制备于实验第15天无菌采取各组动物胸腺及脾脏，放入预冷的Hanks’液中，以毛玻璃片充分研磨后，过100目尼龙网，制成单细胞悬液。脾细胞溶红细胞后调整细胞浓度为5106/ml。

　　1.2.4胸腺淋巴细胞自发增殖实验在96孔培养板中加入上述各组胸腺细胞100 μl/孔，每一样本作3复孔，于37℃、5%CO2培养箱培养3 d，结束前18 h加3H-TdR1 μci/孔，培养结束后，用多头细胞器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，温箱烘干后用β-液体闪烁计数仪测放射活性，结果以cpm值表示，每一样本取3复孔均值。! g  {7 ]8 P* c. @: L7 Q
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　　1.2.5脾淋巴细胞有丝分裂原诱导增殖实验在96孔培养板中加入上述细胞100 μl/孔，实验组脾细胞加ConA，终浓度为5 μg/ ml，对照组不加ConA，以正常培养体系代替，每一样本作3复孔，于37℃、5%CO2培养箱培养3 d，结束前18 h加3H-TdR1 μci/孔，培养结束后，用多头细胞器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，温箱烘干后用β-液体闪烁计数仪测放射活性，结果以cpm值表示，每一样本取3复孔均值。2 `; Q' H1 G9 r' W- ~( @4 U& P1 o8 W
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　　1.2.6肝移植区域组织损伤观察分别于术后第2天和第5天取各组动物移植区域肝脏，甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色。显微镜下观察及数码照相。

　　1.2.7统计分析应用SPSS14.0进行t检验。
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　　2结果
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　　2.1MSCs分离、纯化及其体外培养的形态学特征开始接种的骨髓细胞，最初主要为造血细胞，形态多样。培养3 d后，可见贴壁细胞，细胞形态以圆形为主，可见不规则、三角形、多角形、有小突起的贴壁细胞。随培养液的更换，悬浮细胞、圆形血细胞被逐渐清除，明显减少，细胞贴壁后开始分裂增殖，体积增大，梭形或纺锤形成纤维样细胞开始出现，突起变大。7 d后，细胞融合成单层，梭形细胞突起明显粗大，细胞呈漩涡状排列。根据生长情况每4～7 d传代一次，传至第2～3代后，细胞形态变得较为均一，绝大部分为细长梭形细胞，也有扁平形带突起的细胞，似成纤维样细胞，细胞可散在生长，也有明显的梭形细胞集落呈克隆样生长 (图1)。2 _" Q* q8 e* f4 {! o9 O% b

　　a.MSCs体外培养原代b.MSCs体外培养二代c.MSCs体外培养三代

　　图1MSCs体外培养三代（1010）（略）
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　　2.2大鼠肝移植模型制备及鉴定肝移植术后第2天处死大鼠，取肝脏移植区观察，移植区切口处呈灰白色，小鼠肝组织移植块被大鼠肝组织包裹，组织切片显示移植块存在，并且大鼠肝脏组织有异常改变。

　　2.3胸腺淋巴细胞自发增殖实验结果显示，无论移植前后接受小鼠骨髓MSCs治疗的异基因肝移植大鼠，即前治疗组(2 278.40±1 738.94)及后治疗组(1 089.00±920.83)的测定值均明显低于未经任何治疗的移植模型组(4 032.60±2 291.92)(P＜0.05)，各组与对照组(12 468.00±27 458.64)比较差异均有显著意义(P＜0.01)。表明小鼠骨髓MSCs治疗后，异基因肝移植大鼠的胸腺淋巴细胞增殖明显受到抑制。
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　　2.4脾淋巴细胞有丝分裂原诱导增殖实验无论移植前后接受小鼠骨髓MSCs治疗的异基因肝移植大鼠，即前治疗组(682.833 3±164.25)及后治疗组(1 008.400 0±64.97)的测定值均明显低于未经任何治疗的移植模型组(3 562.500 0±2 725.25)（P＜0.05），与对照组(3 232.500 0±2 082.29)比较差异均有显著意义(P＜0.01)。表明小鼠骨髓MSCs治疗后，异基因肝移植大鼠的脾淋巴细胞增殖明显受到抑制。
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　　2.5肝移植区的损伤修复移植术后2 d，模型组移植区可见移植组织块被大量炎性细胞包围，中心呈干酪样坏死，正常肝组织结构消失；前治疗组及后治疗组移植区炎性细胞明显减少，中心隐约可见肝组织结构(图2)，移植术后5 d情况类似，但损伤程度均较2 d时减轻(图3)。
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　　图2肝移植术后2 d移植区HE染色图（略）

　　图3肝移植术后5 d移植区HE染色图（略）
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　　3讨论

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　　细胞移植在临床上已广泛应用于多种疾病的治疗，异基因造血干细胞移植是目前治疗白血病等恶性血液病的最有效的治疗方法。但为减少移植物抗宿主病的发生，常在移植前使用免疫抑制剂或以亚致死剂量放射线照射受体进行预处理，对骨髓以外的脏器有较大的毒性作用，老年人无法耐受。而且，即便是致死剂量清髓性预处理也不能将患者体内的肿瘤细胞全部清除，移植后复发率很高且常发生GVHD。Ferrara 等〔8〕对22例平均64岁急性骨髓性白血病患者成功地进行了自体干细胞移植,1年后有9 例完全缓解,其余13 例死于AML 的复发。这虽然证明了干细胞的疗效,也表明对60 岁以上的老年患者有较好的效果，但复发率较高，而且对老年患者的采集也有一定的困难。0 ^' o$ ~+ {7 w3 L
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　　MSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，免疫原性弱，易于从骨髓中分离、纯化及体外扩增等特点越来越受到人们的重视。异体移植与供体不匹配、GVHD弱的MSCs的临床应用已有报道〔9，10〕，异基因移植的骨髓MSCs不仅具有多向分化能力，而且具有特殊的免疫耐受性，能够在异基因环境中存活。这为应用异基因骨髓MSCs进行细胞治疗提供了可能。! C+ U  y+ z8 }; c3 ^1 a) ~0 Y

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　　本实验为MSCs在异基因宿主体内移植成功及进一步分化提供了实验依据，我们未对受者进行任何处理，观察到将小鼠骨髓MSCs输注给肝移植模型大鼠后，能在有免疫能力的异种大鼠体内存活并修复损伤的肝组织，而且可抑制胸腺和脾脏淋巴细胞的增殖，无论移植术前后输注均具有相似的作用。提示我们有可能在不给老年患者带来伤害的条件下，将异体骨髓MSCs分离纯化后输注给患者，可引起免疫耐受，从而减少免疫抑制剂的应用，提高细胞移植治疗老年疾病的疗效。但异基因移植时，供者骨髓MSCs抑制受者淋巴细胞增殖的机制有待进一步阐明，MSCs的纯化也是不容忽视的问题。# ?% ^1 J) S& @. y5 H: H2 V0 A

      【参考文献】6 u$ h/ I, ^: p2 \0 ^8 |
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　　2  Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cell derived from adult marrow〔J〕.Nature,2002；4189(1):41-9.

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　　3  Lange C，Bassler P，Lioznov MV,et al.Hepatocytic gene expression in cultured rat mesenchymal stem cells〔J〕.Transplant Proc,2005；37(1):276-9.( z8 v0 {0 Z( O1 V4 s* H/ ]
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　　4  Ryan JM,Barry FP,Murphy JM,et al.Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection〔J〕.J Inflam（Lond）,2005；26(1):2-8.4 u- z+ }7 y7 {* ~

　　5  Tse WT,Pendleton JD,Beyer WM,et al.Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells：Implications in transplantation〔J〕.Transplantation,2003；75(3):389-97./ `1 W* B7 x8 B" z- t* k% }$ D
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　　7  Farida D，Pascale P，Claire B,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tum or growth in allogenic animals〔J〕.Blood,2003；102(10):3837-44.

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　　8  Ferrara F，Veditti A，Carellajr AM,et al.Autologous stem cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia aged over 60 year〔J〕.Eur J Haematol，2002；69(1)：200-4.) c* u1 S0 k+ j8 h% Y* @
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　　9  Koc ON，Day J，Nieder M,et al.Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachrom atic leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IH)〔J〕.Bone Marrow Transplantation,2002；30(4):215-22.% G- e3 S4 b; }! |

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　　10  Fouillar DL，Bensidhoum M，Bories D,et al.Engraftment of allogeneic mesenchymal stem cells in the bone marrow of a patient with severe idiopathic aplastic anemia improves stroma〔J〕.Leukemia,2003；17(2):474-6.

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