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作者：王昌耀作者单位：青岛大学医学院附属医院关节外科，山东 青岛 266003
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. G0 V/ Q8 C) b* N, C 【关键词】骨髓 间充质干细胞 软骨细胞 影响因素
$ J. s' Q- A- N$ T( {2 a3 s' o 关节软骨在受到创伤后,难以自行修复。传统的治疗方法如软骨下骨钻孔术、软骨移植、骨膜或软骨膜移植、软骨细胞移植等因修复组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性,故不能取得满意效果。而应用组织工程方法修复关节软骨缺损却展示了令人鼓舞的前景。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件。骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于骨髓的一群非造血干细胞,在不同诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞分化的潜能。MSCs因具有易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化、供区损伤小、便于自体移植、在适宜的体内或体外条件下可分化形成软骨组织等特点，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。现就影响MSCs向软骨细胞表型分化的因素综述如下。
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1培养方法% k. D" W' K! Z7 ? w
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目前，绝大多数实验室采用低糖DMEM培养基进行MSCs的分离与扩增，少数实验应用DMEM/F12、αDMEM进行，因为低糖条件比高糖条件更利于MSCs的增殖［1］。传代细胞接种密度多为(3～7)104/cm2。MSCs向软骨诱导分化多使用高糖DMED培养基，再添加地塞米松、Vit C以及培养基添加物ITS(insulitransferrinsodium selenite media supplement)等构成不完全诱导培养基。实验时再添加有诱导分化作用的细胞因子,如转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等即可构成完全诱导培养基。
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为模拟胚胎时期软骨形成的体内环境，越来越多的试验者倾向于应用高密度培养或所谓的微球（pellet）方式来重现胚胎发育过程中的软骨前体状态。目前认为,通过离心处理使MSCs聚集成团,利于细胞间的自分泌与旁分泌,更符合软骨生长的要求。PITTENGER等［2］采用离心沉淀式培养法刺激MSCs向软骨细胞分化。首先通过离心使MSCs细胞形成小的团状沉淀,然后静置培养,10～14 d后,细胞形态由梭形变为肥大软骨细胞状,表达软骨细胞的特异分子标记物Ⅱ型胶原及胞外基质中蛋白聚糖丰富。并且,随着培养时间的推移,具有软骨细胞分子标记物的细胞数量越来越多。培养3个月,通过组织学观察可见软骨细胞样陷凹。
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2细胞因子" Z) b& d0 M: ]5 z+ s
8 y! N1 y! O1 `. G, ~诸多试验表明，细胞因子对体外培养的MSCs有着强大的诱导分化能力，其中尤以TGF超家族成员效能最强。
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2.1TGFβ系列生长因子 a3 i1 D2 ~2 m8 U; w% _
3 H$ a$ G" `9 E4 M* vTGFβ系列生长因子(TGFβ1、β2、β3)是一族具有多种功能的多肽,它们能够促进细胞增殖,调节细胞分化,促进细胞合成并分泌细胞外基质。1998年JOHNSTONE等［3］率先在体外诱导成年哺乳类MSCs分化生成软骨获得成功。其培养液的成分为:DMEM液,ITS和Premix(含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐),细胞聚集培养时加入TGFβ1 0.5～10 ng/L。微球细胞团在37 ℃体积分数0.05 CO2环境下培养,7 d时出现Ⅱ型胶原阳性表达,以后逐渐增强，21 d后形成的聚合物完全类似软骨的形态,甲苯胺蓝染色观察证实其具有软骨基质的特征,可检测到Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原mRNA表达,而Ⅰ型胶原不表达,说明MSCs形成的是软骨组织,并且为终末表型的肥大软骨细胞。1 I& s6 @) {+ T9 N* v. ]5 _
6 U7 [" G7 n* X" }& MWORSTER等［4］在MSCs培养液中加入不同浓度的TGFβ1,结果表明，经5 ng/L TGFβ1处理的MSCsⅡ型胶原mRNA含量是对照组的1.7倍,Ⅱ型胶原免疫组化染色区域和强度与TGFβ1的浓度呈量效增长关系。在进一步的研究中，WORSTER等［5］观察了MSCs在含TGFβ的单层培养基及含胰岛素样生长因子(IGFⅠ)的三维纤维条件培养基中的软骨发生,结果显示，0或5 ng/L的TGFβ作用6 d后,置于0或100 ng/L的IGFⅠ的三维纤维条件培养基中,13 d后行Ⅰ、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组化测定蛋白多糖及DNA含量。开始4 d中,TGFβ作用的MSCs明显增殖,形成细胞集落,蛋白多糖增加2倍;IGFⅠ作用后,包括蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA等软骨细胞功能指标显著增强;TGFβ作用后不经IGFⅠ作用的细胞,软骨生成指标表达减弱,提示MSCs的分化尚不完全,但两种因子具有协同作用。
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, |( R! O) l* _2 VBARRY等［6］进一步研究发现，TGFβ2和TGFβ3诱导MSCs向软骨细胞分化的能力强于TGFβ1,并将聚集培养的MSCs向软骨细胞分化的过程分成3个阶段：第1阶段为诱导分化前6 d,标志为纤维调节素及软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达的上调;第2阶段为分化的第7天左右,标志为Ⅱ型胶原和软骨粘连蛋白的表达,同时硫酸软骨素逐渐增多;第3阶段为接下来的14 d,糖胺多糖逐渐累积,最终形成成熟的软骨细胞。
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! b' E7 F$ q" U2.2BMP, G# _8 J2 `7 X3 I5 E) f _4 X
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BMP是TGFβ超家族的成员之一,它具有诱导MSCs转化为软骨细胞或骨细胞的能力，并与其他生长因子存在一定的协同作用。SEKIYA等［7］用BMP6处理MSCs,发现BMP6能明显地促进细胞增殖，扩大蛋白多糖的染色范围；培养1周后即检测到Ⅱ型前胶原mRNA。加入500 ng/L BMP6, 10 ng/L TGFβ3, 10-7 mol/L地塞米松的成软骨培养液中培养,微球的总体积增大,质量增加10倍,染色显示蛋白聚糖合成增加,但无地塞米松或TGFβ3时效果不明显；微球的体积和蛋白聚糖染色深度增加，说明在微球培养液中加入BMP6,可增强人MSCs的成软骨分化能力，且BMP6与TGFβ存在协同作用。COLTER等［8］调整了JOHNSTONE等［3］的培养液,将DMEM换为高糖DMEM，并加入500 ng/L BMP6,10 ng/L TGFβ3,将人的MSCs离心成微球后培养21 d,与对照组相比,MSCs更容易分化成软骨组织,形成的细胞体积更大,含更多的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。BMP2与BMP9也能协同诱导骨髓MSCs定向软骨分化，并能拮抗IL1等炎症因子对细胞分化的抑制作用。
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2.3bFGF% m0 d( P8 |- C+ {$ h7 h! U8 y
) J8 L7 D+ U7 T' j" {" M: ~bFGF具有强烈的促进细胞增殖作用,10 ng/L的浓度下可以明显地促进MSCs增殖。同时,它还能促进软骨基质,特别是Ⅱ型胶原的合成,并阻止蛋白聚糖的降解。MARTIN等［10］研究表明,在体积分数0.01胎牛血清基础上加用bFGF扩增的MSCs接种于支架后产生的三维组织均质性更高,且有更高的湿质量和糖胺多糖含量,干湿质量比例、糖胺多糖、胶原含量与骺软骨含量相似。TSUTSUMI等［11］在体外扩增MSCs时,加入bFGF或不加bFGF,扩增后在成软骨培养液中行微球培养(培养液中无bFGF)4 d后,加入bFGF组微球的表面出现球形软骨细胞,并被软骨特征性的蛋白多糖围绕,第8天,所有的MSCs变成球形的软骨细胞,所有的3～9代MSCs培养16 d后皆形成软骨样组织,而不加bFGF组的MSCs成软骨分化显著延迟。每一代细胞,加bFGF组比不加bFGF组的糖胺聚糖(GAG)含量和Ⅱ、Ⅹ型胶原mRNA的含量都高。说明MSCs在体外扩增时加入bFGF,维持了MSCs的成软骨分化能力。另据BUTNARIU等［12］报道,以106/cm2的高密度接种,用无血清培养基加用bFGF(25 μg/L)、地塞米松(0.4 mg/L)等可诱导MSCs分化为软骨细胞表型,比例可达85%～95%。
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' F8 u+ J9 i9 [9 \: j7 c/ |2.4催乳素（PRL）! E$ n# b' [2 B1 G( M; O1 I3 V5 e
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OGUETA等［13］研究了PRL调节MSCs生长和成软骨分化的作用，结果表明，PRL促进了细胞的增殖,诱导蛋白多糖的合成,在与地塞米松联合作用时,表现为细胞呈柱状纵向排列的软骨组织样结构。
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3支架材料
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# w% x5 m' C' {5 ?$ N干细胞培养的最终目的是要使MSCs再功能化，以构建新的组织或器官。优良的支架材料不仅能为细胞聚集提供场所，保证细胞营养供应，甚至可以促进细胞信息传递，影响细胞的增殖与分化。应用于干细胞培养中的支架材料应具有以下特点［14］:①良好的生物相容性;②多孔的三维立体结构,孔隙率应达到80%以上,各孔相连通,从而具有很大的内表面积,利于细胞的贴附、营养成分的流入及代谢产物排出;③材料逐渐降解、吸收,不影响新生成组织的结构和功能,降解率与细胞增殖、分泌基质的速度基本一致;④具有良好的表面活性,利于细胞的贴附并为细胞生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境;⑤可被加工成一定形状，并有一定的机械强度,使新生的软骨具有一定的外形,可被固定于关节缺损处;⑥关节镜手术中选择的载体材料在操作过程中应保持液态,当到达受区时可转变为固态,并且在体积上无任何改变。
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8 r3 ?: c# d7 |$ {8 I# T4 y( _6 U目前，应用于组织工程领域的支架材料主要分天然基质和人工合成基质两大类。天然基质成分包括胶原、透明质酸、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸盐等,它们可作为MSCs向软骨分化的载体成分。但存在孔隙率不够高的问题,材料中间的细胞难以获得营养,同时降解吸收的速率难以控制,缺乏一定的机械强度,大量获取困难。人工合成的基质有:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物。它们为多孔或非编织纤维网结构,孔径大于100 μm,中空体积达90%,可以吸附大量细胞,保证细胞与外界物质交换,具有可降解性,在数月至数年内可完全被体内组织取代,是MSCs良好载体。但存在着细胞亲水性差,材料的降解时间和降解速率不易控制,孔隙率、孔径越大则材料本身机械强度和可塑性越差的矛盾。此外,材料的降解产物可能对组织细胞产生影响,引起无菌性炎症反应［15］。 : A% b& }9 e* ~9 O
0 C o% T4 J# z8 PMAJUMDAR等［16］将扩增3代的人MSCs以25109/L的密度包埋于海藻酸盐珠中,使用无血清培养基加用100 nmol/L的地塞米松和10 μg/L的TGFβ3培养3周,结果显示，Ⅱ型胶原免疫组化反应为阳性,Ⅱ型胶原mRNA表达量可比未行TGFβ3处理者增加9倍。" N6 D4 }& ~1 o+ Q
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将MSCs掺入Ⅰ型胶原凝胶经体外培养同样可以促使MSCs分化生成软骨。HUANG等［17］将含TGFβ1的胶原凝胶涂在可吸收支架上,与6个月的兔MSCs复合,植入兔的皮下、肌肉和骨膜下,培养2周和4周后,骨膜下的支架含大量的软骨细胞,说明涂有TGFβ1的支架可防止MSCs迁移,并有促进软骨形成的能力。
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NOTH等［18］将密度为1.5109/L的人MSCs与可降解材料复合,在无血清含TGFβ1的成软骨培养液中培养3周,组织切片观察显示，有软骨形态的细胞层形成,周围有蛋白多糖基质环绕,免疫组化分析显示在细胞外基质中有Ⅱ型胶原和连接蛋白,RTPCR检测到软骨特征的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ胶原和蛋白聚糖的基因表达,扫描电镜观察可见表面类似紧密的透明软骨,提示在支架材料上立体构建的软骨细胞较单层培养软骨细胞有更高生理活性，可作为修复人关节软骨缺损的初始模型。
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/ g( B. C( n& e' b3 z4物理因素5 E3 r- M* [1 Y* I; h
3 ~4 ]7 {) B- o9 u应力刺激是软骨发育过程中的重要条件。而静止的软骨培养条件缺乏必要的应力刺激，与体内的动态条件相差甚远。吕昌伟等［19］将MSCs在三维培养状态下分为两组,实验组给予0.2 Hz周期性流体应力刺激,于转壁生物反应器中培养；对照组静止培养,两组均于相同条件培养基内诱导软骨组织形成。2周后实验组表达更高水平的Ⅱ型胶原和蛋白多糖,细胞活力明显高于对照组。表明周期性流体应力刺激可以明显促进MSCs向软骨细胞表型分化,转壁生物反应器培养方式明显优于常规的静止培养体系。正常应力条件下的动物实验也证实了应力环境对MSCs向软骨分化具有诱导作用。王刚等［20］将15只日本大耳白兔制成髌骨外侧脱位动物模型,以兔MSCs为种子细胞构建自体组织工程移植物修复关节软骨缺损，术后6周,移植物正常应力组修复组织浅层为软骨组织,甲苯胺蓝染色接近正常关节软骨;深层为软骨下骨,与正常关节软骨结构相似；移植物脱位组为骨组织所修复,缺损周围的正常关节软骨变薄,软骨下血管侵入正常关节软骨内。提示在正常应力条件下,修复组织浅层的MSCs向成软骨细胞系转化,深层的则向成骨细胞系转化,异常应力使修复组织浅层及深层的MSCs均向成骨细胞系转化。说明MSCs在体内向软骨细胞的分化与应力环境密切相关，只有在正常应力状态下修复效果最佳。4 z; \, L5 n3 ?4 ~
7 C. \/ o) a# z! s! I关节腔内环境是一种低氧的环境，在体外常规培养条件下生长良好的细胞到关节腔内未必能良好适应。MOUSSAVIHARAMI等［21］通过观察体积分数0.21、0.05两种氧分压下的软骨细胞和间充质干细胞的培养发现，在体积分数0.21氧分压下的软骨细胞和间充质干细胞的增殖受到严重的削弱，并且氧化产物大量堆积，从而认为这两类细胞已适应体内的低氧压环境，过高的氧分压对此类细胞的培养会产生不利影响。 t) g8 P7 u5 n) a) k/ a
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5问题与展望
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, m$ x7 d( ~8 F8 V3 @除上述影响MSCs向软骨细胞分化的因素外，体内是否还有更有效的软骨细胞诱导分化因子存在；MSCs向软骨分化的关键外部刺激信号及信号传导途径是什么；MSCs的软骨细胞表型维持需要什么样的条件；MSCs经体外诱导分化构建的软骨细胞移植物对关节腔内恶劣的高压、高张力、低氧分压等理化环境的适应如何；以及支架材料的制备等问题,是目前研究的热点问题。随着基因工程、材料工程等技术向细胞培养领域的渗透与交叉，MSCs研究将不断深入,相信在不久的将来它有可能成为临床医生修复软骨损伤的得力工具。) W3 S9 }$ W& t% q4 T! `& q# B. a) w
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发表于 2009-3-3 12:29
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