小分子（12kD）蛋白western blot转膜条件

dilal

我最近想检测一下ESC中一种小分子蛋白（thioredoxin）表达情况，我采用半干转及湿转进行转膜，但是2个月了也没有跑出来。问师兄都只做过大分子的蛋白，没有跑过这么小的蛋白。希望哪位做过小分子蛋白的给指点指点，具体的转膜条件。包括转膜电压，转膜时间。我做的分子蛋白是12KD左右。$ O; Y4 ]( R) m7 E8 _* ]
谢谢！

皮搋子

建议你先跑一个胶，用考马斯亮蓝染色，用来确定你跑胶没问题，确认蛋白没有跑出去。' }4 N* ^5 k7 _+ Z; C

; p4 |! `5 i+ h5 I5 w因为蛋白很小，很容易与上样缓冲液那条带混在一起跑丢了，还是先确定一下吧。
# L3 C% h4 w* Z( s- a3 Y4 Z+ Q' N( B$ e; Y5 C
如果没问题，正常转就可以了。
- H' g% z& O% u, Y5 l! M
! d# a1 w$ \  D- z7 o# Q你先做一次，有问题的话再讨论。

franklinhg

首先 你知道这个蛋白的分子量  是理论的分子量  其实还可能有一些修饰的 比如乙酰化 糖基化等那么要考虑分子量的问题  其次 你买的抗体怎么样？特异性 效价 亲和力等 是否适合做WB？ 再次 你可以用预染的蛋白marker试一试 确定你的目的蛋白没有跑到胶外去  但是这个也不是很好 因为目的蛋白的电泳的特性和marker的不完全一致 所以也是误差比较大的  最保险的方法是跑tricine电泳  在    精编分子实验指南  这本老实验书上有 那是做小分子蛋白的经典方法 以上是我的个人经验  请大家批评指正  谢谢大家！叩首。

franklinhg

前面是猜想的是电泳问题   现在关于转膜这个步骤：小分子量的蛋白你可以用3.03克的tris 15.15克的甘氨酸 外加20%的甲醇 添水到一升的转移液的配方，不要加入SDS。SDS的作用是是蛋白带电 尤其是针对大分子的蛋白的 想想在上样缓冲液中为什么要加入SDS？？？呵呵 中和各个蛋白自身的电荷 包裹成火柴棍状  然后大家蛋白的电荷差异基本没有 就只有分子量这个因素了  所以转小分子量蛋白时候 不要加入SDS。我只是有个经验值：分子量在25---100KD以内的 电压100V  湿法 转移45分钟效率是很高的。 当然我也有发飙的时候 200V转移10分钟 效果一样的好。 我建议你转移条件是 湿法  电压100V  时间20分钟左右吧。当然你要先解决前面可能的电泳问题哈   谢谢  在叩首

dilal

回复 4# franklinhg , d( U, B, k+ }  x/ l5 Q
0 r- F. t( T: [

# c6 e8 z, M8 S    谢谢，回去好好试一下

medliujuan

学习了，谢谢！

dingyx2009

不知你用的膜的孔径是多大的？一般的PVDF膜是0.45um，转膜时间太长控制不好就会转通透到滤纸上，分子量20KD以下，建议用0.22um的膜，现在都有买的，一小张的。你可以试试。

王乾

你没做出来可能有两种原因，一是跑胶是把蛋白跑掉了，因为你的蛋白很小，另外有时蛋白在胶上的位置和它的大小不一致，主要是氨基酸组成的原因。7 w$ R2 ?0 t% \; A( z8 @1 O6 y
另一个原因是你转膜的时候转过了，12KD建议你用PVDF膜，湿转15分钟，当然具体你还要再试一试。

daxi-fighting@1

6 d' D- A' F4 c9 g, L: w+ i+ k  P8 N$ p  e' y+ m
我从今年八月份开始做western，也遇到了同样的问题，12,11kd的蛋白，用的3.03gtris，15.01g的甘氨酸，200ml甲醇，800ml的双蒸水配的转缓，90v，0.2um的PVDF膜，湿转转膜20min，做了很多次了，都快两个月了，都没做出来。着急啊，文章结果就差它了。求助啊，求助

daxi-fighting@1

回复 王乾 的帖子. n6 _/ k* j3 G! g  u

: z& _) @7 k* ~! ?& z你好，请问你做这种12kd的蛋白跑胶的时候有什么特别注意的吗？我都是配的15%的聚丙烯酰胺胶，电泳的时候你是跑到什么程度呢？是看着上样缓冲液不跑过夹子的绿色的线，不跑过玻璃板的最下端还是比这个更早就停止电泳吗？我每次看到10kd的marker转膜后都在膜上，可曝光的时候还是没有。连核内参H3.1（17kd）都没做出来，欲哭无泪啊