神经干细胞脑内移植对血管性痴呆大鼠认知功能的治疗研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：陈江瑛作者单位：广州市红十字会医院神经内科，广东广州 510220 ! [2 z+ W' t- J: H8 Y! r

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      & f. B4 g8 o. i4 O  @7 i6 o7 T
      7 M4 @4 w, ?7 y- C

      【摘要】  目的研究神经干细胞脑内移植对双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）所致血管性痴呆（VD）大鼠认知功能的改善作用。 + j0 {  @$ E1 F) k/ e
      【关键词】神经干细胞移植血管性痴呆认知功能+ `# {, }( r. V% K: c
   　　Study on cognitive function improvement after transplantation of neural stem cells into brain of rats with vascular dementia
: I* m+ h  |( j: l
　　CHEN Jiangying, ZHANG Suping, HE Rui,WANG Muzhen,LIANG Ruihua,XU Wuhua  n; \! w$ L" E6 [4 s3 V

3 X! A2 W+ N( S. y
) ]" t* _3 }7 [: o+ a% \
　　(Department of Neurology, Guangzhou Red Cross Hospital, Guangzhou,Guangdong510220)6 Q/ ~( A' ^1 r1 d4 s+ d
$ N9 Q$ Z% A: g. y( O' t( a5 f
　　Abstract:Objective To study improvement of cognitive function impairment of vascular dementia rats induced by a permanent bilateral ligation of common carotid arteries (2VO) after transplantation of neural stem cell in brain. Methods VD model of rats was established by 2VO. The Morris water test was performed to detect difference in the cognitive function between VD group and control group. After transplantation of neural stem cell in brain, cognitive function improvement of VD treatment group was observed. ResultsNeural stem cell could be differentiated into mature neuron after transplantation into rat brain. Morris water test showed that latency time was shorter and average velocity was increased in VD treatment group. Conclusion Cognitive function impairment could be improved by transplantation of neural stem cell in brain in VD rats.

　　Key words:neural stem cell; transplantation; vascular dementia ; cognitive function% X  z3 o$ m$ S2 [5 c; G
& \( Q  F& U( r# J/ s4 f; [
　　血管性痴呆（vascular dementia， VD）是指各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征，以记忆、认知功能缺陷为主，是老年性痴呆中最常见的类型之一，仅次于阿尔茨海默（Alzheimer）病，目前尚没有肯定的治疗方法可以改善整个病程［1］。近年来，干细胞技术的基础研究逐渐完善，特别是神经干细胞的脑内移植研究的逐渐开展，给许多难治性神经系统疾病的治疗带来希望。本文采用神经干细胞脑内移植治疗VD模型大鼠，研究其对VD大鼠认知功能的治疗作用。
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　　1材料与方法! a" L& f, p& S' {2 L# P" N
7 j7 U& a, C9 s8 |& [; i

* g* j6 `7 }" `8 C; }- E" r1 n
　　出生后第1天SD大鼠4只；老龄健康SD大鼠30只，月龄大于16个月，雄雌各半，体质量300～450 g，由中山大学北校区实验动物中心提供，合格证号：（医动字）第2699c016号；混合培养基DMEM/F12（1∶1）干粉购置Hyclone公司；bFGF、EGF、无血清培养添加剂B27购自Gibco公司；兔抗大鼠神经元核抗原单抗（NeuN）和抗nestin单抗购自Chemicon 公司；胞膜红色荧光标记物（PKH26）购自Sigma公司；其他试剂为国产分析纯，购自南京化学试剂公司。

　　1.1神经干细胞的分离培养和纯化  C4 s. y: _7 B, r6 a" k* P
( U+ L9 X3 m) [4 ^
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　　出生后第1天SD大鼠4只，10％(φ)水合氯醛腹腔麻醉，断头后将头分离置于75％(φ)酒精中浸泡5 min。按照Paxinos－Watson图谱沿矢状位切开脑组织，分离海马，置于含有DHankes液的培养皿中。用眼科剪将所分离的海马剪碎至1 mm3，分装于离心管中，静置5 min，弃上清，加入0.1%胰蛋白酶3 mL，置37 ℃水浴箱中水浴15 min，每5 分钟振荡8～10次，以1 000 r/min离心10 min，弃上清，以培养液悬浮细胞，接种于25 cm2培养瓶中，培养液为DMEM/F12（1∶1），按照1∶50(体积比）添加B27，按20 ng/mL的质量浓度加入bFGF和EGF，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养。每3 天换液1/2，每次按20 ng/mL的浓度加入新鲜的bFGF和EGF，将原代培养8～10 d的神经球机械吹打制成单细胞悬液，以50 000/mL的细胞密度接种培养，每8～10天操作1次，连续传代。9 X, I. k) S4 r. W+ m
* F5 ^% e3 @, S' a: x

　　细胞移植前4 d，1 000 r/min离心10 min收集细胞，弃上清液，细胞重悬于含B27和20 ng/mL bFGF的DMEM、F12培养液，按照试剂盒说明书，将5 μmol/L细胞膜标记红色荧光－PKH26加入培养液中，置于37 ℃，5％CO2孵育箱中，培养4 d后，1 000 r/min离心，收集神经干细胞，加入新鲜无血清培养液。取10 μL细胞悬液，用台盼蓝染色，显微镜下可见细胞均着色，备用。- b( g! z* S/ m4 z
% S/ W2 X# n; Q% E
　　1.2抗nestin免疫荧光染色

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* R2 d" j* u5 y- _- w; ?
　　培养第4代的细胞将4％(φ)多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后，用0.2%Triton100 处理30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，用2％牛血清白蛋白（用 PBS稀释）进行非特异性封闭30 min，然后加入兔抗大鼠一抗（抗nestin抗体，1∶100）孵育，4 ℃过夜，次日用PBS冲洗3次，每次5 min，加入标记绿色荧光抗兔二抗（1∶200）室温下孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，常规封片，并在荧光显微镜下观察，拍照。以 PBS代替一抗染色作为空白对照，步骤同上。

　　1.3VD大鼠模型制作# G" L  _6 K$ u# o: ^3 W
) d7 _5 \7 {1 G* D$ \
% A6 z7 Q0 g% G! _4 `. E1 u- o

　　将30只大鼠随机分为2组，假手术组10只和VD组20只，采用持久性双侧颈总动脉结扎法（2VO）建立血管性痴呆的老年大鼠模型［2］。用2％戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉并结扎，缝合切口，假手术组除不结扎双颈总动脉外，其余处理与实验组相同。

　　1.4神经干细胞移植5 l+ |7 U( x4 K# b( _2 t2 c

　　取VD大鼠16只，分VD治疗组8只，痴呆组8只。取VD治疗组8只大鼠，2％戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠头部脱皮，消毒，正中切口，暴露颅骨。在脑立体定位仪下，采用平颅头位，以前囟为0点的定位坐标系统，定海马部位［4］，牙科钻钻孔至骨膜，暴露硬脑膜及其以下的皮质组织。在硬脑膜上切口，用5 μL微量进样器取细胞悬液2 μL，通过硬脑膜上切口，1 μL/min注入细胞至海马内。明胶海绵固定针体，留针10 min，缝合头皮。术后继续笼养1个月，然后进行下一步实验。

　　1.5Morris水迷宫测试

9 U9 z3 u: m0 ]! j; c

　　实验装置如文献所述［3］。该阶段为5 d，反映实验大鼠的学习记忆能力和空间定向能力，以Morris水迷宫第3象限池壁中点为出发点，实台设置在第一象限中央。将大鼠面对池壁轻轻从出发点处放入水中，同时摄像仪开始自动记录大鼠的游泳轨迹以及入水后找到实台的时间（潜伏期）、平均速度。" V7 [3 q, ^2 z2 ]6 I

　　1.6抗NeuN免疫荧光染色  [+ a' Y' }7 |% H

0 q7 Q4 ^! t3 F

　　取VD治疗组大鼠2只，痴呆组大鼠2只，分别用2％戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧固定，剪开胸腔，暴露心脏，将连续灌注液的针头插入左心室，剪开右心耳，用PBS（pH=7.4）灌注约5 min，待右心耳流出的液体为无色透明时，用4％多聚甲醛磷酸缓冲液灌注20 min。掀开颅骨，快速取出全脑，以移植位点为中心，冠状位切取脑组织，将脑组织固定2 h。冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、冠状切片，制成5 μm厚连续切片。按照试剂盒操作步骤进行NeuN免疫组化，即首先将切片常规脱蜡，0.1%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，用2％牛血清白蛋白（用PBS稀释）进行非特异性封闭30 min，然后加入兔抗大鼠一抗（NeuN抗体，1∶100）孵育，4 ℃过夜，次日用PBS冲洗3次，每次5 min，加入标记绿色荧光抗兔二抗（1∶200）室温下孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，常规封片，并在荧光显微镜下观察，拍照。以 PBS代替一抗染色作为空白对照，步骤同上。

　　1.7统计学分析

* z& H9 r  U- |, P$ C+ \

　　使用SPSS 12.0软件，采用方差分析和均数间多重比较q检验, 以P
% f3 V* G( b# }! Z4 O
4 e" x4 L6 m; F& E/ C$ I7 {) ]

　　2结果

　　2.1神经干细胞的培养和鉴定

　　新生原代细胞在无血清培养液中培养至第4～5 天，可见到约几十个细胞组成的悬浮细胞球，即神经球；第7 天以后神经球逐渐长大，神经球大小不等，在悬浮液中贴近于培养液的底部（见图1A）。将第4代培养的神经球贴壁后进行nestin免疫荧光染色，可见神经球呈nestin阳性，发出绿色荧光。（见图1B）。
, d! E7 h0 `3 L$ f- z4 f4 ]
  C! B9 W9 q; j- v4 \( m& T+ l
, L8 N) n+ [: j3 w" a3 V
　　鉴定神经干细胞以其表达nestin抗原为标志，免疫组化证实所有的神经干细胞nestin均呈阳性。nestin是一种中间丝蛋白，存在于神经外胚层上皮干细胞中，在中枢神经系统的发育过程中瞬时表达。本实验将传代培养的神经球进行nestin染色，显示呈阳性，提示由单细胞分裂增殖形成的细胞球为神经干细胞。原代培养形成的神经球传代后仍能形成新的神经球，并可以连续传代，证明培养细胞具有自我更新能力。因此，我们所培养的来自海马的细胞是神经干细胞。
3 ?; f4 i- l1 Z7 N
　　图1原代培养的细胞形成大小不等的神经球（A）和神经球nestin免疫荧光染色（B）（200）（略）

　　Fig.1Primary cultured cells could form neurospheres in various sizes and Neurosphere nestin immunofluorecent staining（200）0 k4 a0 P2 w2 K& s8 {* c) u
+ e0 r  _% p9 P; M
　　2.2神经干细胞在缺血脑组织中的分化
) H$ z( `3 z* C- r7 `

　　在VD移植组大鼠大脑的海马区域可以观察到许多红色荧光标记物PKH26（见图2A），表明该处存在注射的神经干细胞，而痴呆组大鼠大脑的海马区域未见到有红色荧光标记（见图2B）。NeuN免疫组化结果发现，在成熟的神经元的神经核的周围，有红色荧光标记，说明神经干细胞在缺血脑组织中可以分化为神经细胞（见图3A-C）。

　　A VD治疗组脑组织内可见到红色荧光! |  k" {9 O, o
% p- K+ v4 Q1 S) v
　　B 痴呆组的脑组织内未见到红色荧光, R! |/ y$ y& Q3 ]
2 Z0 k6 D1 B) Z$ `
　　图2荧光标记结果（200）（略）2 G( O) T, A; G9 F7 N  H

　　Fig.2The rusult offluorescent marker (PKH26) （200）

　　A VD治疗组，海马区NeuN荧光标记阳性细胞（绿色荧光标记,200）9 a4 T% M1 A, Q# C* n6 p

　　B 同一视野下，可以观察到许多红色荧光标记物PKH26（200）

　　C 为图A，B合成像片（同一视野，200）
; ?5 |, i- P0 A+ Z  |8 t
　　图3移植的神经干细胞在缺血脑组织中可以分化为成熟的神经细胞（200）（略）# b- ^2 K. {* J3 I6 v' y: R/ l: C! R
4 s3 W+ i: a) j- }1 ?7 E
　　Fig.3Transplanted neural stem cell could differentiate into mature neural cell in ischemic brain tissue（200）5 G' g0 ^0 g8 M6 b7 m! J% U) L9 O* s  F
5 j7 _3 D( b0 m5 T; K% f4 t
　　2.3VD模型大鼠认知功能的改善
' \1 A: P$ n7 [" `
' M7 G1 Z$ B) X5 n6 \& x8 A8 ]  Z

　　Morris水迷宫实验中，VD大鼠的潜伏期明显长于假手术组（P
5 b: o: m9 j0 t
0 G6 o: f& `2 |: b7 d5 L$ _+ a( Z
  _) i( u+ d% R+ B+ K8 o
　　图4大鼠入水后找到实台的平均速度（略）

　　Fig.4Average velocity at which rats find platform. l+ D; ], N+ A

　　图5大鼠入水后找到实台的潜伏期（略）
; Z# k5 O  M8 q: R* K
　　Fig.5Latent period for rats finding platform( s$ t# P- n* [: M' g5 N
' X- {+ B6 z/ t( r
　　3讨论8 O+ Z( {/ y- @( \+ J4 D( C
% v0 P/ F: ~$ c6 [/ ]* U

　　VD动物模型的建立方法，主要有双侧颈总动脉结扎模型、四血管阻断法、血管内栓塞法、VD自发模型等。持久性双侧颈总动脉结扎法建立动物模型，较其他方法制作简单，可以造成稳定的不完全性前脑缺血，而脑干灌流良好，能维持生命中枢的基本功能，接近慢性脑灌注不足时脑组织病理生理演变过程，适用于慢性脑缺血的研究［5］。本实验表明，用该方法建立的VD动物模型，没有明显的运动障碍，利于长时间观察和研究，且经Morris水迷宫实验证实，大鼠的学习记忆能力有明显下降。) Q  w( O4 U- R7 {1 E
2 X5 q) Q4 T6 Z1 A6 j- }

+ Q  }6 }( l3 X" k/ o. z+ |6 [8 N
　　神经干细胞是指具有自我更新能力并且能够分化为神经组织主要成分——神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞的一种干细胞［6］。目前，神经干细胞脑内移植治疗难治性神经系统疾病成为近年来的研究热点，Nishino等［7］将胚胎大鼠中脑的神经干细胞经体外培养两周后移植给帕金森病大鼠模型，使由甲基苯丙胺诱导产生的旋转大鼠症状半数以上明显改善。Gao等［8］将人胚胎干细胞移植入脑损伤大鼠脑内，发现2周后，大鼠的认知功能得到一定的改善。Cameron等将外源性神经干细胞移植入海马内，受其内环境影响，亦分化成神经元［9］。叶建新［10］等从新生大鼠的脊髓中分离培养出神经干细胞，然后移植入大鼠血管性痴呆大鼠脑内，免疫组化证实，移植组大鼠脑内可见到较多的胆碱乙酰转移酶能（ChAT＋）神经元，而痴呆组大鼠脑内ChAT＋神经元分布稀疏，数量明显减少，ChAT＋神经元越多说明胆碱乙酰转移酶活性越高，合成的ChAT则增加，对于修复痴呆大鼠的记忆障碍提供理论依据。
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  }1 j+ W, H3 o( b' \
　　对移植的神经干细胞进行预先标记，以便于移植后对它们的存活和分化进行追踪。本实验用红色荧光标记物标记的神经干细胞，将其移植入痴呆大鼠的脑组织，结果发现在损伤的脑组织内有许多被荧光标记的细胞，而且较为分散，这说明移植进入脑组织的神经干细胞不但能存活，而且存在着迁移的现象，目前不清楚是哪些信号诱导了神经干细胞的迁移，以及存活细胞的比例是多少。本研究表明，VD大鼠和假手术组大鼠相比，认知功能下降，当给予神经干细胞脑内移植后，VD大鼠的认知能力与未给予治疗的VD组相比，认知功能得到明显改善。这说明植入的神经干细胞参与了损伤脑组织的修复过程或替代了坏死神经细胞的功能。然而神经干细胞与周围的神经细胞如何建立突触联系，还值得进一步深入研究。
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　　神经干细胞脑内移植是治疗VD的一种潜在的方法，为恢复脑缺血损伤后的脑功能提供了新的思路。
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